肾肿瘤中浸润性树突状细胞的免疫状态变化

【摘要】  目的 通过分析肾肿瘤中浸润性树突状细胞的免疫状态变化，以探讨其在肾肿瘤微环境中的功能状态。方法 选择未经任何非手术治疗的肾透明细胞癌患者标本40例作为实验组，10例正常肾组织作为对照组，通过免疫组织化学技术标记组织中树突状细胞(dendritic cell, DC)的CD1a、HLA-DR和CD86抗原，观察正常肾及肾透明细胞癌组织中DC的3种抗原的表达，结果进行统计学分析。结果 所有肾透明细胞癌组织中均未见明显CD86+ DC，但均有CD1a+ DC，其在肾癌组织中的浸润程度明显高于正常肾组织(P<0.001)，但CD1a+ DC与肾癌临床分期及组织学分级均无相关性；在肾癌组中有34例癌实质内的DC表达HLA-DR抗原，其阳性表达率为85%，与正常肾组织80%的阳性表达率相比无统计学意义(P>0.05)。结论 DC具有趋化性，可以向肿瘤组织聚集，肾癌组织中存在CD1a，肾癌患者CD86表达低下，提示肾癌患者DC存在免疫缺陷，而DC的免疫功能低下则可能是肾癌逃避宿主免疫监视的主要原因。

【关键词】  树突状细胞；肾肿瘤；免疫状态

    树突状细胞(dendritic cell, DC)是目前已知功能最强的抗原提呈细胞(antigen-presenting cell, APC)，能诱导针对肿瘤相关抗原的特异性T淋巴细胞反应，DC最大的特点是能够显著刺激初始型T细胞(naive T cells)增殖，其抗原提呈能力是其他抗原提呈细胞的10-100倍［1］。诸多的研究证实，DC能在体外摄取肿瘤抗原，并在体内激活初始T淋巴细胞产生抗原特异性，从而在肿瘤免疫中发挥重要的作用。然而，肿瘤宿主本身DC并没有激发机体免疫系统产生有效的抗肿瘤效应，说明肿瘤微环境中的DC，即肿瘤浸润性DC(tumor infiltrating dendritic cell, TIDC)可能存在免疫缺陷，从而导致肿瘤的免疫逃逸。因此研究TIDC有助于揭示肿瘤免疫逃逸的机制。本文采用免疫组化技术，对40例肾癌患者TIDC的免疫状态进行分析，以探讨肾癌中TIDC与肿瘤免疫的关系。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  标本收集  在新疆石河子大学第一附属医院1990-2006年收治的肾肿瘤患者中，筛选出初发并且未经任何非手术治疗患者的手术切除标本40例，男性26例，女性14例，年龄38-73岁，平均55岁。术后病理证实为肾透明细胞癌作为实验组。组织学分级以往最常用的是1982年Fuhrman四级分类［2-3］。1997年WHO推荐将Fuhrman分级中的Ⅰ、Ⅱ级合并为1级即高分化、Ⅲ级为中分化、Ⅳ级为低分化或未分化。故采用将肾癌分为高分化、中分化、低分化(未分化)的分级标准［4］。分期采用2002年AJCC的TNM分期和临床分期［2］。40例肾透明细胞癌中高分化28例，中分化9例，低分化(未分化)3例；临床Ⅰ期29例，Ⅱ期9例，Ⅲ-Ⅳ期2例。另外,收集该院的正常肾组织标本10例作为对照组。

    1.1.2  主要试剂和设备  鼠抗人CD1a(购自中国福州迈新公司)，鼠抗人CD86(购自R&DSystems公司，英国)，鼠抗人HLA-DR(购自上海基因公司)。免疫组化成套试剂盒(购自中国福州迈新公司)。

    1.2  方法

    1.2.1  标本处理及切片制作  所有标本均经10%(体积分数)中性甲醛溶液固定后，常规石蜡包埋，取4 μm厚的连续切片，置于65 ℃烘箱内烘烤6 h以上备用。

    1.2.2  免疫组化染色(S-P法)  按有关试剂的产品说明书进行操作。常规脱蜡至水，滴加过氧化物酶阻断剂10 min后行抗原修复。依次滴加一抗，生物素标记的二抗。每步骤后均用缓冲液(PBS)洗涤5 min，DAB显色，苏木素复染，干燥，中性树胶封片。抗原修复方法：针对CD1a、HLA-DR及CD86采用不同的抗原修复方法。CD1a于二氨四乙酸二钠(ethylenediaminete-traacetic，EDTA)(pH 8.0)修复液，HLA-DR、CD86于枸橼酸缓冲液(pH 6.0)修复液中，微波炉强火3 min左右至煮沸，微波炉低火5 min，连续3次。实验对照：以PBS代替一抗作为阴性对照,以正常肾组织作为阳性对照。

    1.2.3  计数方法  由3位病理科主治医师阅片。每张切片任意取DC分布最密集的5个区，在高倍视野下(HPF×400)计数CD1a阳性细胞的数目。以5个高视倍视野下CD1a阳性细胞平均数代表该标本切片中的DC浸润程度。采用成组资料样本均数的t检验统计分析实验组与对照组的CD1a+ DC浸润程度。HLA-DR以细胞膜或胞浆染成黄色、棕色或棕褐色且其染色强度高于背景非特异染色者为阳性细胞；同一阳性片中，不同区域染色强弱不尽相同。按许良中［5］等级评分方法，根据阳性染色强度和阳性细胞所占百分比对HLA-DR表达进行评估。按染色强度评分：无色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分；按染色阳性细胞所占百分比评分：阴性0分，阳性细胞<10% 1分，11%-50% 2分，51%-75% 3分，>75% 4分。阳性率的确定由经验丰富的病理医生协助进行，两者相乘分值>3为阳性，分4等级：-(<2分)、+(3-4分)、(5-8分)、(9-12分)。

    1.2.4  统计方法  采用SPSS11.5统计软件进行统计学处理。实验结果以均数±标准差表示，原始数据作方差齐性检验后作t检验；多组间比较采用One-Way ANONA分析。

    2  结    果

    2.1  抗原表达状况  CD1a在癌组织中有强阳性表达，表达部位为DC的胞浆和胞膜(图1)。CD86在肾细胞癌未见确切表达，在正常肾组织中主要分布在肾小管细胞(图2)。HLA-DR表达特异性较差，阳性细胞为细胞质内和(或)细胞膜呈棕黄色颗粒着色(图3)。

    2.2  DC浸润程度

    2.2.1  CD1a+ DC的浸润程度  CD1a阳性DC在肾癌组的浸润数目高于正常肾组织组，其差异有显著性(P<0.001，表1)。高分化肾癌患者CD1a+ TIDCs浸润程度与中分化和低分化之间无明显的统计学意义(表2)。Ⅰ 期肾癌患者CD1a+ TIDCs浸润程度与Ⅱ 期和Ⅲ-Ⅳ 期之间无明显的统计学意义(表3)。表1  肾癌组织与正常肾组织中CD1a+ DC的比较 表3  肾癌组织CD1a＋TIDCs与肾癌的临床分期的关系

    2.2.2  DC表达HLA-DR的状况  肾癌组的癌实质内浸润的DC表达HLA-DR的阳性率较正常肾组织升高，但其差异无显著性(P>0.05，表4)。表4  肾癌组织与正常肾组织中DC 的HLA-DR阳性表达率的比较

    3  讨    论

    DC是目前已知功能最强的抗原提呈细胞。在体内，它经历不成熟到成熟的发育过程。随着发育成熟，DC能表达一系列分化抗原，其中与功能直接有关的是CD1a、MHC-I类分子、HLA-DR、CD80、CD83、CD86等。本研究通过免疫组织化学染色观察发现，DC胞体形状不规则，向外伸出长短不等的突起，这一形态特征与DC的功能有密切关系，这使其能有效地摄取抗原并选择性地作用于体内数量极少的抗原特异性淋巴细胞，从而发挥抗原提呈的作用。

    在DC的一系列分化抗原中CD1a是一种递呈脂类抗原的分子，目前被公认为DC的主要特征性标志，已广泛地应用于DC分离、纯化和体外培养的鉴定。笔者采用CD1a免疫组化技术标记DC，结果表明肾癌中CD1a+DC的浸润程度明显高于正常肾组织。表明DC具有趋化性，可以向肿瘤组织聚集。同时研究发现CD1a+DC的浸润与肾癌临床病理分期及组织学分级均无明显的统计学意义，提示肿瘤组织中的未成熟DC数量不能作为肿瘤预后的指标。CD86在肾细胞癌中未见确切表达，正常肾组织主要表达于肾小管细胞，表明和其他器官的肿瘤一样，肾细胞癌中CD86的表达明显下降。近年的研究证明，CD86表达于APC主要是DC表面，与表达在T细胞上的配体CD28、CD152结合后，提供协同刺激信号，导致T细胞的活化［6］。由于肿瘤细胞的共刺激分子的低水平表达,不能使肿瘤抗原引起有效免疫应答，从而诱导了T细胞的无能状态,使得机体的免疫系统不能将肿瘤细胞清除,是肿瘤无限制性生长的主要原因之一［7-8］。因此，可以认为肾细胞癌表达共刺激分子CD86的水平下降可能与肿瘤细胞“逃避”机体的免疫监视有关。HLA-DR是MHC-Ⅱ类分子,能与经胞内处理的抗原多肽结合而高表达于成熟DC的表面,以利于DC的抗原提呈。HLA-DR的不表达或低表达说明DC提呈外源性抗原能力低下。本研究结果显示，在40例肾癌实质内有34例存在HLA-DR+DC，其阳性表达率为85%，较正常肾组织内DC的HLA-DR表达率略高，但差异无显著性。说明肾癌中浸润的DC经历肿瘤抗原刺激，产生一定程度的HLA-DR表达，且HLA-DR表达程度高于CD1a和CD86，这可能由于该抗原在DC中存在时间较长，而CD86和CD1a分子仅存在于DC成熟过程中的某一特定阶段，存在时间较短，随DC功能状态的改变而表达缺失。至于TIDC功能成熟缺陷以及浸润程度下降的可能机制，有实验研究证明：①癌细胞可诱发DC的凋亡，从而导致DC在肿瘤微环境中的数量下降［9］；②肿瘤细胞分泌的血管内皮生长因子,可于造血前体细胞水平抑制DC而导致荷瘤宿主DC的数量减少［10］；③肿瘤分泌的其他一些因子，如IL-10可以抑制DC的分化成熟，下调共刺激分子的表达，并可抑制DC在肿瘤内的聚集［11］，TGF-β可显著抑制DC的产生和DC的分化成熟［12］。

    综上所述，TIDC的异常破坏了机体的局部免疫监视系统与肾癌的发生有密切关系，由于成熟的TIDC数量少及TIDC功能缺陷使得肿瘤抗原无法被有效提呈，加之DC表面共刺激分子和黏附分子的低表达或不表达，不能提供激活T细胞所需的共刺激信号，影响DC的抗原提呈能力，因而无法诱导肿瘤特异性杀伤性T细胞反应，最终导致肾肿瘤的免疫逃逸。提示临床上可以通过使用DC疫苗或者其他手段增加肿瘤内成熟DC数量与活性，通过产生更多的表面刺激因子，从而有效地提呈肿瘤抗原，提高机体对肿瘤的免疫杀伤力。

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作者单位：石河子大学医学院：1. 2005级外科学硕士研究生；2. 第一附属医院泌尿外科；3. 病理科，新疆石河子 832008