RNA干扰技术及其在泌尿系肿瘤治疗中的应用

【关键词】  RNA干扰 泌尿系肿瘤 治疗

　　RNA干扰(RNA interference, RNAi)，是一种在动植物中广泛存在的通过双链RNA(dsRNA)分子在mRNA水平上诱导特异性序列基因沉默的过程，即转录后基因沉默(posttranscriptional gene silencing, PTGS)，由与被抑制基因同源的dsRNA启动。目前有效治疗肿瘤方法有放疗、化疗和免疫治疗，但恶性肿瘤细胞对这些治疗方法均有抵抗作用。RNAi作为公认的科学成就之一，很有希望成为一种新颖可靠的恶性肿瘤治疗方法。

　　1  RNA干扰
   
　　1998年卡耐基研究院Fire等研究发现，用纯化后的dsRNA注射线虫，能高效、特异地阻断相应基因的表达，其抑制基因表达的效率比纯化后的反义RNA至少高2个数量级，称此现象为RNAi。随后，发现RNAi现象广泛存在于果蝇、原虫、植物、真菌、拟南芥、水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核生物中。Elbashir等在2001年报道RNAi现象存在于哺乳动物细胞中，揭开了RNAi应用于哺乳动物细胞研究的新篇章。2006年诺贝尔奖生理/医学奖颁发给了RNAi的两位发现者，美国科学家安德鲁·菲尔和克雷格·梅洛。植物、动物、人类都存在RNAi现象，这对于病毒感染的防护、控制活跃基因过表达具有重要意义。RNAi已经作为一种强大的“基因沉默”技术而广泛应用。

　　1.1  RNA干扰的作用机制  RNAi可能作用机理包括以下三个步骤。①启动阶段：细胞质中内源性或外源性长dsRNA首先与Dicer酶的dsRNA结合区结合，形成DicerdsRNA复合物，在Dicer酶的RNase活性作用下，长dsRNA被Dicer切割为21-23nt(核苷酸，nucleotide)的siRNA(small interference RNA)双链。②效应阶段：Dicer通过PAZ结构域与含有PAZ结构域的Argonaute蛋白互相作用，核酸内外切酶、解旋酶与Argonaute蛋白相连，进而与siRNA一起形成具有多个亚单元的核糖核苷酸蛋白复合物(RNA inducing silencing complex, RISC)。RISC中的解旋酶应用ATP解开siRNA双链，使其反义链互补结合到靶向mRNA上与之相匹配的特异性序列，RISC中的核酸酶降解mRNA，降解的mRNA随后迅速地被细胞其他RNA酶所降解，从而使目的基因沉默，产生RNAi现象。③此外，解开siRNA的双链后，反义RNA链能作为双链RNA合成的一个引物，以mRNA为模板，在RISC中RNA依赖的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerases, RdRPs，又称作RDRs)的作用下形成新的dsRNA，再次被Dicer识别并切断，形成新的siRNA再循环作用于另外的靶向mRNA。这种不断放大的瀑布式作用形成大量新的siRNA，使RNAi作用在短时间内迅速、有效地抑制mRNA翻译形成蛋白质或多肽,从而有效地抑制了靶向基因蛋白质或多肽的合成[1]。

　　1.2  RNA干扰的优势  RNAi具有许多传统方法无法比拟的特点和优势。它有5个显著的特征：①高特异性：只引起与dsRNA同源的mRNA降解,不影响其他无关基因的表达。②高效性：极少量的dsRNA就能有效抑制靶基因的表达。③多功能性：一些对RNA 3′端富含CG的研究证明存在很多潜在的RNAi作用靶点[23]。④可传播性和可遗传性：RNAi基因表达的效应可以在不同细胞甚至生物体间长距离传递和维持，并可传递给下一代。⑤稳定性较强：siRNA在细胞内可稳定存在3-4d，半衰期远长于反义寡聚核苷酸。

　　2  RNA干扰在泌尿系肿瘤治疗中的应用
   
　　肿瘤的发生是多基因参与并经多阶段演变而形成的多基因疾病，RNAi现象的发现为肿瘤的基因治疗提供了一种新的思路，有可能成为肿瘤基因治疗的新策略，具有较好的应用前景。

　　2.1  在前列腺癌治疗中的应用  脂肪酸合酶(FASE)是饱和脂肪酸合成的关键酶，因为人所需要的脂质绝大部分是从饮食中获取，所以绝大多数人体组织中FASE的表达很低。FASE在许多人类上皮癌中过度表达，它是抗肿瘤治疗的靶点之一。Schrijver等[4]通过RNAi介导FASE基因表达下调，使前列腺癌细胞株LNCaP细胞中甘油三酯和磷脂的合成显著下降，引起细胞形态学的显著变化(包括细胞体积变小、细胞间接触消失、细胞星形足的形成等)，阻滞了LNCaP细胞的生长并诱导其发生凋亡。而RNAi介导的对FASE基因的抑制并不影响良性皮肤成纤维细胞的生存能力及生长率。
   
　　环氧化酶2(COX2)在肿瘤的发生、发展中起着重要作用。尽管COX2在前列腺癌中的作用仍存在争议，但最近的研究显示雄激素受体信号、促炎症反应、细胞周期调节基因等表达的改变促进前列腺癌的发生。因为一些基因及转录因子的激活，前列腺癌经常由雄激素依赖性转变为雄激素非依赖性，以致削减了雄激素的疗效。Narayanan等[5]利用RNAi介导的COX2抑制，能够在mRNA水平沉默COX2，诱导转移性前列腺癌细胞停止生长，下调雄激素受体和细胞周期调节蛋白D1。

　　2.2  在膀胱癌治疗中的应用  Survivin是凋亡蛋白抑制剂(IAP)家族成员，它是近年来发现与癌相关的最重要的基因之一，survivin及其他抗凋亡蛋白(如bcl2)的上调与肿瘤抗凋亡诱导治疗相关[6]。Ning等[7]通过siRNA介导的survivin阻滞，使发生P53基因突变的膀胱癌细胞的存活能力下降，转染后的膀胱癌培养细胞的凋亡率增加了50%-60%。
   
　　Fuessel等[8]利用反义核酸(ASODN)ASSVV286和siRNA siSVV284阻滞膀胱癌细胞株EJ28和5637中survivin的表达，并将它们作为化疗的增敏剂。对用这两种阻滞剂预处理过的膀胱癌细胞予以放疗后发现癌细胞的生存能力显著下降，癌细胞凋亡率的增加、细胞数目的减少与survivin表达下调的程度呈正相关，siRNA的作用比ASODN更有效。而将两种基因下调的方法与化疗药物结合后亦发现了显著的癌细胞抑制效应，并且小剂量的化疗药物即能引起显著的抑制效应。这为膀胱癌放、化疗的应用提供了一种新的思路。
   
　　抗凋亡基因bcl2、bclxL和XIAP常常与肿瘤细胞对化疗的抵抗性相关。Kunze和Wuttig等[9]利用脂质体介导的siRNA对膀胱癌细胞EJ28和T24中此三种基因分别实施了干扰，在siRNA转染后的24h，靶基因的mRNA下降了35%-80%。进一步研究发现，对mRNA转录效率的下调，2个靶基因的联合干扰比单个基因干扰强。另外他们联合RNAi与化疗药物作用于膀胱细胞的研究发现细胞生存能力亦显著下降。
   
　　表皮生长因子受体(EGFR)在调节细胞生长及分化过程中起着关键的作用。许多研究表明EGFR与肿瘤对放疗的抵抗性呈正相关，相反，对EGFR信号的阻滞能够提高瘤细胞对放疗的敏感性。EGFR是通过其在细胞内部分的自磷酸化，激活下游的Ras和磷酸肌醇3(IP3)激酶等从而进一步产生效应。多种人肿瘤细胞(如膀胱癌细胞)常发生Ras的激活，提高肿瘤细胞的生存能力，放疗和化疗后的肿瘤细胞其Ras的表达增高，产生对放化疗的抵抗性，当阻断Ras信号通路的传导后，能够恢复瘤细胞对放化疗的敏感性。Kim等[10]通过siRNA介导的对Ras、IP3激酶和Akt的阻滞，提高了膀胱癌细胞株T24细胞对放射治疗的敏感性。EGFR对膀胱癌的侵袭性亦有着重要的影响，Ding和Wang等[11]研究发现Id1(细胞分化抑制剂)的上调与EGFR表达的增加相关，他们利用RNAi技术使Id1失活，进而下调了EGFR的表达，抑制了肿瘤细胞的侵袭。Id1将可能成为抑制膀胱癌侵袭性的治疗靶目标。
   
　　相当一部分浸润性膀胱癌同时表达粒细胞集落刺激因子(GCSF)和粒细胞集落刺激因子受体(GCSFR)，Chakraborty和White等[12]对膀胱癌细胞株5637(只分泌GCSF，但不表达GCSFR)的研究发现，膀胱癌细胞自分泌GCSF/GCSFR信号并以β1整合素依赖性的方式对其黏附及侵袭性起着至关重要的作用。他们以siRNA特异性地阻滞膀胱癌细胞GCSF的表达，发现GCSF/GCSFR自分泌信号(能够使5637细胞的侵袭能力提高10倍)受到了显著的抑制，癌细胞的黏附性和侵袭性降低。

　　2.3  在肾癌治疗中的应用  Chung等[13]发现与正常的肾细胞相比，肾细胞癌(RCC)中原癌基因Axl的转录物mRNA 及其表达产物在稳定期水平显著增长。他们利用dsRNA来沉默肾癌细胞中的Axl基因，结果与对照组相比，经RNAi技术处理过的肾癌细胞中Axl基因的表达下降了50%，流式细胞仪分析结果显示，G1/G0期细胞DNA含量增加了30%。研究显示利用RNAi抑制肾癌细胞中原癌基因Axl，可能为肾癌的治疗提供了一条途径。
   
　　肾细胞癌(RCC)的转移和侵袭性与神经节苷脂(ganglioside)的含量相关。RCC TOS1细胞具有高度的转移性，富含单唾液酸神经节苷酯GM2(β1,4GalNAcGM3)和二唾液酸神经节苷酯RM2抗原(β1,4GalNAc disialyl Lc4)，而GM3阴性。GM2和RM2抗原具有相同的β1、4GalNAc末端结构，RM2抗原为黏附受体。Hiroshi Aoki等[14]利用siRNA抑制了β1，4GalNAc转移酶的形成，进而减少了GM2的合成，结果发现GM3含量增高，癌细胞的转移性及侵袭性显著降低，但RM2抗原的含量并没有发生变化。
   
　　DNA异常的甲基化会使肿瘤细胞逃避先天性和获得性的免疫攻击。肾癌细胞对免疫系统的逃避可能是因为IFN应答基因启动子的超甲基化，导致其抵抗IFN诱导的抗增殖和凋亡效应。Reu和Bae等[15]研究发现，对人ACHN肾细胞癌细胞予以DNA脱甲基作用物，如核苷类似物5AZA2′脱氧胞苷酸(5AZAdC)或反义的DNA甲基转移酶1(DNMT1)，能够克服IFN诱导的癌细胞抗凋亡效应的抵抗，使85%的癌细胞发生凋亡。通过甲基化特异性的聚合酶链反应证实了5AZAdC引起的脱甲基作用和凋亡相关的IFN应答基因XAF1的存在。他们利用siRNA沉默XAF1，结果发现抑制了IFN诱导的凋亡效应，相反，XAF1的过度表达能够减弱βIFN诱导的抗凋亡效应的抵抗。

　　2.4  在肾上腺癌治疗中的应用  锚着非依赖的人肾上腺腺癌细胞株SW-13细胞的生长必需补充外源性的生长因子，如成纤维细胞生长因子(FGFs)。Estes和Thottassery等[16]研究发现，SW-13细胞表达成纤维细胞生长因子受体(FGFRs)1、3和4 mRNA，但不表达FGFR2 mRNA。他们利用RNAi策略抑制了FGFR1和FGFR3的表达，进一步抑制了FGF2或FGF4介导的SW-13细胞集落的形成。而RNAi介导的FGFR4基因的抑制，对锚着非依赖的SW-13细胞集落的形成无明显影响。研究结果表明FGFR1和FGFR3对SW13细胞的生长是必需的，这为人肾上腺腺癌的基因治疗提供了一种可能途径。

　　3  展望
   
　　RNAi技术最主要的特点是可以调节和关闭基因的表达，进而调控细胞的各种高级生命活动。这不仅提升了人们对RNA分子的认识，也会大大推进基因功能的研究，更为肿瘤等医学顽症的根治，开辟了一条新的有效途径。随着RNAi技术研究的不断完善和广泛应用，它必将对生命科学的发展产生深远的影响。

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作者单位：南京军区南京总医院泌尿外科，江苏南京 210002