CD40分子在肾癌组织中的表达研究

【摘要】  目的 探讨肾癌组织中CD40分子的表达与癌发生浸润转移的关系。方法 用免疫组织化学二步法(Envision法)对甲醛固定石蜡包埋的肾细胞癌组织(32例)和癌旁组织(10例)中CD40的表达情况进行研究，并分析CD40分子表达水平与肾癌临床分期、病理分级和发生淋巴结转移的相关性。结果 CD40在肾细胞癌组织中表达的阳性率为87.5%，与肾癌癌旁组织组相比，具有显著性差异(P<0.01)；CD40的阳性过度表达与肿瘤临床分期、病理组织学分级和淋巴结转移显著相关(P<0.05)。结论 CD40分子在肾癌中的异常表达可为肾癌的诊断、治疗及指导预后提供实验依据，并为进一步研究肾癌的生物学，尤其是为抑制Fas和TNFR介导的细胞凋亡与基因治疗肾细胞癌打下基础。

【关键词】  肾癌 免疫组织化学 CD40

　CD40分子是肿瘤坏死因子受体(tumour necrosis factor receptor, TNFR)/神经生长因子受体(nerve growth factor receptor, NGFR)超家族成员，广泛存在于B细胞、单核细胞、树突状细胞、内皮细胞和造血干细胞等中，是免疫应答中重要的共刺激分子。CD40分子还异常表达于一系列上皮性肿瘤组织中，且与肿瘤的转移及预后有明显的相关性[1]。本研究探讨肾癌组织中CD40分子表达与癌组织浸润转移及预后的关系，并选择肾癌癌旁组织作对比分析。

　　1  材料与方法

　　1.1  临床资料  选择2002年10月-2004年2月间南京大学医学院附属鼓楼医院病理科保存的32例泌尿外科手术切除的肾癌组织石蜡标本。临床组织标本中，肾透明细胞癌21例，肾颗粒细胞癌8例，肾梭形细胞癌2例，肾混合细胞癌1例。术前经肾动脉栓塞治疗15例。根据体格检查、辅助检查和手术及病理结果进行分期(TNM分期)，Ⅰ期4例，Ⅱ期15例，Ⅲ期11例，Ⅳ期2例。按组织病理分级(1997年WHO分级)，G1级(高分化)6例，G2级(中分化)17例，G3级(低分化)9例。术前及术中发现腔静脉或肾门淋巴结转移者8例，术前发现肾静脉或腔静脉癌栓者2例。男性23例，女性9例，男女比例2.6∶1。年龄25-82岁，平均年龄48.3岁。术前均未行化疗或放疗。选取同期肾癌癌旁组织(距肾癌边缘2cm以上的组织，病理检查未见癌组织浸润)标本10例作对照分析。

　　1.2  试剂  鼠抗人CD40单克隆抗体(美国Santa Cruz生物技术有限公司)；Envision免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒为丹麦Dako公司产品。

　　1.3  检测方法  取肾癌组织石蜡标本，4μm厚度连续切片，按Envision法免疫组织化学检测，具体操作歩骤按试剂盒说明进行。CD40免疫组化均用PBS取代一抗做阴性对照；CD40阳性对照：大B细胞淋巴瘤免疫组化标本。

　　1.4  结果判断  CD40阳性表达主要位于细胞膜上，呈棕黄色或棕褐色。阳性表达标准参照Barnes等[2]提出的基于3个参数的半定量计数方法，即染色强度、阳性细胞数和两者记分的乘积。A项(阳性细胞计数)：光镜下随机观察10个高倍视野，记录1000个肿瘤细胞内阳性细胞数的百分比，无记0分，阳性细胞数百分比1-10计1分，11-50记2分，51-75记3分，>75记4分。B项(着色强度)：无色记0分，浅黄色记1分，棕黄色记2分，棕褐色记3分。每例标本最后得分为A×B：0分为阴性，1-2分为弱阳性(+)，3-4分为阳性，大于4分为强阳性；3分以上为过度表达。

　　1.5  统计学处理  采用卡方(χ2)精确检验法，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  CD40在肾细胞癌及癌旁组织中的表达  CD40在肾癌癌旁组织中的表达主要为阴性或弱阳性表达(图1)。CD40分子在肾癌组织中有不同程度的表达，阳性染色位于肾癌细胞膜上(图2-4)。32例肾癌中CD40阳性表达28例(87.5%)，其中阳性过度表达者21例(65.6%)。与肾癌癌旁组织相比，CD40在肾癌中的表达率具有统计学意义(P<0.01，表1)。

　　图1  肾癌癌旁组织细胞膜CD40表达阴性 (Envision法 ×100)（略）

　　图2  肾透明细胞癌细胞膜CD40阳性过度表达 (Envision法 ×100)（略）

　　图3  肾透明细胞癌细胞膜CD40阳性过度表达 (Envision法 ×200)（略）

　　图4  肾透明细胞癌伴淋巴结转移细胞膜CD40过度表达 (Envision法 ×100)（略）

　　表1  CD40在肾癌癌旁组织、肾癌组织中的表达（略）

　　2.2  CD40分子表达与肾癌临床分期的相关性  对CD40表达与肾癌的临床分期进行了相关性分析，表明CD40在肾癌中的过度表达与肿瘤临床分期显著相关(P<0.05，表2)。

　　表2  CD40在肾细胞癌中的过度表达与临床分期的相关性分析（略）

　　2.3  CD40分子的表达与肾癌病理分级的相关性  对CD40表达与肾癌的病理组织学分级进行了相关性分析，表明CD40在肾癌中的过度表达与肿瘤的病理分级显著相关(P<0.05，表3)。

　　表3  CD40在肾细胞癌中的过度表达与病理分级的相关性分析（略）

　　2.4  CD40的表达与淋巴结转移的相关性  8例有淋巴结转移的肾癌组织中，均为CD40阳性过表达，阳性率为100%；24例非淋巴结转移肾癌组织中，CD40表达阳性为13例，阴性为11例，且其表达阳性组表达的强度较淋巴结转移组弱，表达阳性率为54.2%。两者具有显著性差异(P<0.05)。经随访证实，淋巴结转移组最长存活时间为48个月，平均16个月；非淋巴结转移组最长存活时间为92个月(至今仍存活)，平均32个月，其中CD40表达阳性患者平均存活约23个月，CD40阴性表达患者平均存活42个月，其远期存活存在显著差异(P<0.05)。

　　3  讨论
   
　　肾癌是泌尿系常见的恶性肿瘤，患病率占全身恶性肿瘤的3%，其中又以肾细胞癌(renal cell carcinoma, RCC)最为常见(80%-85%)。临床上30%-40%的肾癌患者就诊时已有远处转移，死亡人数逐年提高。国外统计自1985年到2000年年死亡人数由54000上升到102000。肾癌的关键治疗手段是根治性肾切除术，但手术对晚期转移性肾癌，并不能达到“根治”的目标；肾癌对放疗、化疗和激素治疗均不敏感。近年来，随着免疫学和分子生物学在肿瘤发生、发展和转移机制领域研究的不断深入，为恶性肿瘤的治疗提供了新的研究方向，肾癌的生物学治疗得到了广泛的开展。文献报道RCC转移灶自然消退率达1%-20%，证明了在肾癌的发展和转归中存在着免疫作用[3]。生物反应调节剂(biological response modifiers, BRMs)是指通过一类物质调节和加强机体的免疫功能或直接显示其细胞毒作用，改变宿主对肿瘤的生物反应状态，而达到抗肿瘤作用。利用BRMs对肿瘤治疗，称为生物学治疗。Pericle等[4]用B71转染人乳腺肿瘤细胞，T、B细胞间经过CD40/CD40L作用后导致T细胞激活，产生细胞毒性T细胞，从而增强对肿瘤细胞的杀伤作用。
   
　　CD40是一类细胞表面分子，其基因定位于20q11-13，是TNFR/NGFR超家族成员。CD40分子广泛存在于B淋巴细胞、树突状细胞、内皮细胞和造血干细胞等中，是免疫应答中重要的共刺激分子，具有促进B细胞活化增殖、信号传导等多种生物学功能。CD40L(CD154)作为自然存在的CD40的配体，主要存在于活化的CD4＋T细胞表面，CD40和CD40L相互作用激活T淋巴细胞，产生细胞毒性T淋巴细胞，从而增强对肿瘤细胞的杀伤作用，导致了肿瘤细胞的生长抑制，增加了对Fas介导的肿瘤细胞凋亡的敏感性[1]。目前有关CD40/CD40L相互作用对机体的B细胞免疫、T细胞免疫、肿瘤免疫和移植免疫的重要作用多已明确，但其具体作用机制尚不清楚。CD40单抗和CD40L均可使CD40膜分子交联和配基化，继而使CD40分子多聚化，此为CD40信号转导的结构基础和始动因素。现认为肿瘤坏死因子受体相关因子(tumor necrosis actor receptor associated factors, TRAFs)为介导CD40分子信号转导的中心分子，可以和CD40胞浆段不同结构域结合，活化下游分子而介导CD40分子的信号通路，产生生物效应，其中最重要的两条通路为JNK通路和NFκB通路[5]。
   
　　同时CD40在多种人类肿瘤如膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌及黑色素瘤中高水平表达。Sabel等[6]发现18例肺癌细胞系中CD40阳性14例(78%)，与转移有关的表面标志检测结果显示，CD40的表达与肿瘤转移有显著相关性，认为CD40可作为显示疾病严重程度的指标。Hussain等[7]发现94例膀胱癌患者中CD40阳性患者平均存活时间为110月与CD40阴性患者平均存活时间为45月相比较显示，CD40的表达与膀胱癌患者的预后相关，CD40/CD40L在膀胱癌患者的免疫治疗中可能具有广阔的应用前景。但CD40在肾癌组织中表达的研究报道不多，Kluth等[8]通过比较CD40分子在12例肾细胞癌与正常肾组织中的表达，发现在肾细胞癌中CD40有高表达，免疫组化的结果显示在肾细胞癌中，CD40的过表达与肿瘤血管浸润显著相关，与肾癌的预后有关。Shorts等[9]通过研究抗CD40抗体在体外和体内对小鼠和人体肾癌细胞的影响，表明CD40阳性肿瘤细胞中CD40的兴奋表达能增强机体免疫反应和抗癌作用。本研究中肾癌组织中CD40高度表达，为肾癌的生物学治疗提供了可能。同时临床前瞻性研究表明，CD40/CD40L的相互作用可以用于肿瘤的免疫治疗，使用竞争型抗CD40单克隆抗体或可溶型CD40L可观察到肿瘤细胞被抑制，有报道皮下注射重组人CD40L抗肿瘤治疗通过了I期临床试验[10]，为肾细胞癌的基因治疗提供了一种新的有效安全的治疗方案。
   
　　本研究采用免疫组织化学方法对不同的肾组织中CD40的表达进行检测，初步研究发现CD40在肾癌组织中的阳性表达率为87.5%，阳性过度表达率为65.6%，表明CD40的表达与肾癌细胞的生物学行为有关；但肾癌癌旁组织中CD40不表达或弱表达，而肾癌组织中大多数有表达，表达存在极显著性差异(P<0.01)，其表达与临床分期、病理分级和淋巴结转移显著相关(P<0.05)；本组中2例患者出现了腔静脉或肾静脉癌栓，其CD40为阳性过度表达，提示CD40可能与肾癌的预后不良有关，可能成为肾癌或其他肿瘤的有价值的预测因子及可能的提示预后指标。CD40的表达将有助于我们了解肾癌的细胞凋亡调控机制和发生机制，并为临床基因治疗肾癌提供新的思路。

【参考文献】
  　　[1]Lee JK, Seki N, Sayers TJ, et al. Constitutive expression of functional CD40 on mouse renal cancer cells: induction of Fas and Fasmediated killing by CD40L [J]. Cell Immunol, 2005, 235(2):145152.

　　[2]Barnes DM, Meyer JS, Gonzalez JG, et al. Relationship between cerbB2 immunoreactivity and thymidine labelling index in breast carcinoma in situ [J]. Breast Cancer Res Treat, 1991, 18(1):1117.

　　[3]Badmus TA, Adesunkanmi AR, Agbakwuru CA, et al. Giant renal oncocytoma masquerading as infiltrating renal cell carcinoma: case report and literature review [J]. Cent Afr J Med, 2006, 52(1):1619.

　　[4]Pericle F, Epling PK. CD40CD40L interations provide third party costimulation for T cell response against B71transfected human breast tumor cells [J]. J Leuk Biol, 1997, 61(2):201208.

　　[5]Ishikawa F, Nakano H, Seo A, et al. Irradiation upregulates CD80 expression through induction of tumour necrosis factoralpha and CD40 ligand expression on B lymphoma cells [J]. Immunology, 2002, 106(3):354362.

　　[6]Sabel MS, Yamada M, Kawaguchi Y, et al. CD40 expression on human lung cancer correlation with metastatic spread [J]. Cancer Immumol Immumother, 2000, 49(2):101108.

　　[7]Hussain SA, Ganessan R, Hiller L, et al. Proapoptotic genes BAX and CD40L are predictors of survival transitional cell carcinoma of the bladder [J]. J Br Cancer, 2003, 88(4):586592.

　　[8]Kluth B, Hess S, Engelmann H, et al. Endothelial expression of CD40 in renal cell carcinoma [J]. Cancer Res, 1997, 57(5):891899.

　　[9]Shorts L, Weiss JM, Lee JK, et al. Stimulation through CD40 on mouse and human renal cell carcinomas triggers cytokine production, leukocyte recruitment, and antitumor responses that can be independent of host CD40 expression [J]. J Immunol, 2006, 176(11):65436552.

作者单位：南京医科大学附属南京第一医院泌尿外科，江苏南京 210006