点击显示 收起
【摘要】 目的 制作犬尿道狭窄动物模型。方法 健康雄性成年犬15只，10g/L戊巴比妥钠(30mg/kg)静脉麻醉后，切开阴茎腹侧包皮，逆行尿道造影，随机抽取3只犬设为对照组，同步观察，余12只犬为试验组，以好克公司F10小儿电切镜直视下行前尿道电切术。术后第15和30天时分别麻醉动物，做尿道镜及尿道造影检查，评价模型制作效果。结果 1只(8.3%)犬死于术后尿道感染，3只(25%)犬术后当天发生尿潴留，术后第15天，4只(36.3%)犬在尿道损伤部位发生瘢痕性狭窄，术后30d，存活的11只(91.7%)犬全部出现尿道狭窄，对照组犬尿道正常。结论 采用小儿电切镜制造犬前尿道损伤能成功制作出尿道狭窄动物模型，为瘢痕性尿道狭窄的发生机理和分子生物学研究提供实验对象。
【关键词】 尿道 狭窄 内切开镜 尿道造影 犬
尿道狭窄是泌尿外科最常见的棘手问题之一，分外伤性和炎症性两种[1]。传统治疗方法有尿道狭窄内切开、狭窄段尿道切除并吻合及尿道替代治疗等[2]，但由于术后远期效果不确定及狭窄复发率高，寻找更有效的治疗手段十分必要。利用动物模型进行尿道狭窄的基础性研究已有成功经验，但多采用兔或鼠等构建模型。雄犬个体较大，其尿道有尿道海绵体支撑，组织形态学更接近人类尿道生理情况。本实验利用内窥镜下电切伤手段，建立犬前尿道狭窄动物模型，为探讨瘢痕性尿道狭窄的分子生物学防治提供理想的研究对象。
1 材料与方法
1.1 实验动物 雄性成年犬15只(由西安交通大学医学院实验动物中心提供)，标准饲料，自由饮水，饲养观察1周。
1.2 主要仪器设备 好克N4210(0°、F10)小儿电切镜(西安三杰电子科技有限公司提供)、Olympus OTVS6内窥镜图像系统、Olympus CLE4E冷光源、SONY Trinitron显示器、高频发生器(西安交通大学医学院第二附属医院泌尿外科提供)、F10导尿管、眼科手术器械(西安交通大学医学院第二附属医院外科动物实验中心提供)、SHIMADZU(岛津)胃肠拍片机(放射影像中心提供)。
1.3 主要药品试剂 10g/L戊巴比妥钠，青霉素钠80万/支，760g/L泛影葡胺，10%(体积分数)甲醛固定液，液氮固定液。
1.4 模型制作 按参考文献[34]作相应改动，制作犬尿道狭窄模型。15只雄犬分批用10g/L戊巴比妥钠(30mg/kg)静脉注射麻醉，仰卧位固定，做阴茎包皮腹侧切开，充分暴露尿道外口。经尿道外口插入F6导管，置管深度1cm，用760g/L泛影葡胺加入生理盐水，稀释至150g/L浓度做逆行尿道造影。随机抽取3只犬设为对照组，同步观察。余12只雄犬用好克F10小儿电切镜，置镜深度5-6cm，电切功率30W，5%葡萄糖作冲洗液，在尿道镜视野内5-7点位置，直视下用直径2mm环状电极行犬前尿道电切术，造成面积约2mm×3mm穿透尿道全层的手术创面。术前1d、术后3-5d用青霉素80万u溶于100mL生理盐水静滴，2次/d。观察每日犬排尿状况，继续饲养1月。术后第15天和30天时分别麻醉动物，做尿道镜及尿道造影检查。术后第31天，所有实验犬被麻醉后，活体采集尿道标本。切取狭窄段尿道组织，标本用10%(体积分数)甲醛溶液固定、石蜡包埋后5μm厚连续切片，分别做HE(苏木素伊红染色液)和VG染色(Van Gieson，胶原纤维染色)。光镜下观察标本的组织形态学改变，进一步证实尿道瘢痕组织的形成。
2 结果
2.1 电切术后排尿状况 所有实验组犬在尿道电切割损伤后均未做膀胱造瘘，观察犬自主排尿状况。在术后3d内，1只犬死于术后尿道感染，3只犬术后当天发生尿潴留，予耻骨上膀胱穿刺排尿一次。全部实验犬均表现出阴茎红肿，有不同程度的排尿困难，以尿流滴沥为主。术后1周，存活实验犬排尿困难症状逐渐缓解，但仍有尿流间断表现。术后2周时各实验犬排尿基本恢复正常。
2.2 电切术后尿道造影情况 对照组犬尿道造影黏膜光滑(图1)。电切术后第15天，4只(36.3%)实验组犬在尿道损伤部位形成瘢痕性狭窄；术后第30天，存活的11只(91.7%)犬在尿道损伤部位均有瘢痕组织形成，导致该段尿道不同程度的狭窄，尿道造影片上有典型切迹表现(图2)。
图1 雄性犬正常尿道造影（略）
图2 雄性犬狭窄尿道造影（略）
2.3 电切术后第30天尿道镜检 F10电切镜下均能清晰观察到实验犬尿道损伤部位的典型环状瘢痕，尿道镜不能自由通过，狭窄环黏膜苍白、结构僵硬、弹性丧失(图3)。
图3 雄性犬尿道狭窄尿道镜下图(箭头所示为狭窄段)（略）
2.4 电切术后第31天尿道组织形态学观察 和正常犬尿道光镜下的组织形态结构(图4)相比，实验犬尿道电切损伤部位管腔上皮变薄易脱落，固有层不连续，大量结缔组织填充且其内可见较多细胞成分，同时可见较多炎性细胞浸润(图5)。VG染色切片光镜下观察，胶原纤维呈红色，于细胞间散在分布。尿道瘢痕组织中胶原纤维粗大，密集成束或成行状排列(图6)。
图4 雄性犬正常尿道光镜下表现 HE×400（略）
图5 雄性犬狭窄尿道光镜下改变 HE×400（略）
图6 雄性犬狭窄尿道VG染色光镜下改变 ×400（略）
3 讨论
尿道狭窄的形成与皮肤瘢痕形成有相似之处，其病理学改变是在黏膜和肌层损伤基础上局部创面过度修复，产生增生性瘢痕，进而破坏尿道完整性并形成狭窄[5]。临床上，尿道狭窄传统的治疗方法有尿道扩张、尿道内切开和尿道成形术等，它们都是在已有瘢痕形成基础上进行的机械性扩张或手术治疗，这些方法不能避免发生再狭窄[6]。尿道狭窄的临床治疗目前仍未突破“狭窄-扩张/手术-再狭窄”的模式。2000年Baskin等[7]证实尿道狭窄的病变部位在间质，与成纤维细胞活化引发大量胶原组织形成有关。我们在先期研究中也发现TGFβ1和胶原蛋白与人类尿道瘢痕形成关系密切，推测抑制TGFβ1过度表达有助于预防和减轻尿道狭窄的发生[8]。
能否抛开传统方式，从分子生物学角度为尿道损伤后创面良好愈合和减少瘢痕形成提供最佳治疗选择，是一种崭新的尝试。1994年Bosnjakovic等[3]利用犬尿道狭窄模型研究了尿道内支架植入疗效；2003年Andersen等[910]利用兔尿道狭窄模型研究了生长激素抑制素拟似物lanreotide对狭窄的防治效果；Jadane等[4]研究了药物halofuginone对兔尿道狭窄发生及复发的预防作用。可见，犬、兔等动物已成为人们研究尿道狭窄防治的理想实验工具。
兔或鼠这类实验动物个体小，抗炎及抗手术打击能力差，加之尿道短小，操作及解剖研究相对受限，而雄犬个体较大，其尿道有尿道海绵体支撑，组织结构与人近似，能更好模拟人类尿道疾病。过去尿道狭窄模型的建立大多为外源性损伤，如挤压伤、横断或尿道外切开术等，而近年来发生在尿道的感染与医源性损伤比例增加，通过电切造成尿道壁损伤与狭窄更符合人类前尿道医源性损伤或感染的病理机制。临床实践证明，电切割及电凝技术中的能量作用可导致尿道瘢痕组织形成和尿道狭窄。已有研究证实尿道损伤后尿液外渗在尿道狭窄形成中的作用至关重要，损伤后尿道周围的炎症反应表明尿外渗的存在与局部组织纤维化关系密切[10]，因此在我们实验过程中，对实验犬未做尿流改道，使其尿液经尿道排出，外渗于损伤局部。另外，通过电切镜可以自由掌控损伤程度并选择尿道狭窄段的长度，为后续研究创造良好条件。电切术后实验犬排尿困难、尿流滴沥；尿道造影表现出典型切迹，尿道镜检发现环状瘢痕，镜体不能自由通过；HE染色见管腔上皮变薄易脱落，固有层不连续，大量结缔组织填充其中，并有较多炎性细胞浸润，VG染色发现胶原纤维粗大，密集成束或成行状排列，上述所有改变与人类尿道瘢痕性狭窄的临床病理相符合。我们研究证实：采用小儿电切镜造成犬尿道损伤，可成功构建尿道狭窄动物模型，为防治尿道瘢痕性狭窄研究提供有效实验工具。
【参考文献】
[1]Fenton AS, Morey AF, Aviles R, et al. Anterior urethral strictures:etiology and characteristics [J]. Urology, 2005, 65(6):10551058.
[2]章咏裳. 应用腔内泌尿外科技术治疗尿道狭窄 [J]. 中华泌尿外科杂志, 1999, 20(1):5860.
[3]Bosnjakovic P, IIic M, Ivkovic T, et al. Flexible tantalum stents: effects in the stenotic canine urethra [J]. CIR, 1994, 17(5):280284.
[4]Jadane M, Bedeir AED, Abdelahad O, et al. The use of halofuginone in prevention of urethral stricture formation and recurrence: An experimental study in rabbits [J]. JOU, 2003, 169(4 Suppl):178.
[5]同济/中山医科大学病理学教研室编著. 外科病理学上册 [M]. 尿道疾病(第二版). 武汉：科技出版社, 1996:693697.
[6]Greenwell TJ, Castle C, Andrich DE, et al. Repeat urethrotomy and dilation for the treatment of urethral stricture are neither clinically effective nor costeffective [J]. J Urol, 2004, 172(1):275277.
[7]Baskin LS, Constantinescu SC, Howard PS, et al. Biochemical characterization and quantitation of the collagenous components of urethral stricture tissue [J]. J Urol, 1993, 150(2):642647.
[8]程伟，孙润芹，呼冬利，等. 人尿道狭窄瘢痕组织中胶原蛋白含量和TGFβ1表达的意义 [J]. 西安交通大学学报(医学版), 2006, 27(2):207.
[9]Andersen HL, Duch BU, Gregersen H, et al. The effect of the somatostatin analoguelanreotide on the prevention of urethral strictures in a rabbit model [J]. Urol Res, 2003, 31(1):2531.
[10]Andersen HL, Duch BU, Nielsen JB, et al. An experimental model for stricture studies in the anterior urethra of the male rabbit [J]. Urol Res, 2003, 31(6):363367.
作者单位：西安交通大学医学院第二附属医院泌尿外科，陕西西安 710004