树突状细胞疫苗对人化荷人膀胱癌SCID鼠循环微转移转归的影响

【摘要】  目的 将人外周血淋巴细胞(PBL)以腹腔转输方法构建具备人免疫环境SCID鼠模型，探讨树突状细胞(DC)疫苗对荷瘤SCID鼠血循环膀胱癌细胞微转移转归的影响。方法 体外侵袭法从膀胱癌细胞株T24中筛选具有高转移能力亚群(T24-3)；从人外周血中分离PBL，经腹腔注射小鼠(4×107/鼠)，1d后，于鼠右后肢内侧皮下接种3×106个T24-3细胞，2、4、5、6周分别检测鼠体内人免疫状态(包括血清IgG水平和CD3+、CD4+、CD8+T细胞数量)及外周血细胞角蛋白20(CK20)mRNA表达；用含10%人AB型血清的RPMI1640培养基，在rhGMCSF和rhIL4存在下，37℃、5%CO2环境下体外诱导培养人外周血单个核细胞(PBMC)来源DC。用冻融法获得的T24-3细胞裂解上清液致敏DC；并干预荷人瘤细胞的SCID鼠自发血循环肿瘤细胞微转移，观察大体情况、外周血CK20mRNA表达及瘤体MMP7mRNA表达。结果 SCID鼠于接种T24-3肿瘤细胞后5周进行DC疫苗干预。DC疫苗治疗组小鼠外周血中CK20 mRNA表达均阴性，无远处转移发生；PBS处理组小鼠外周血中有2例CK20 mRNA表达阳性，3例发生远处转移；DC治疗组小鼠外周血中有1例CK20 mRNA表达阳性，1例发生远处转移。DC疫苗治疗组小鼠瘤组织中MMP7 mRNA表达最低，较PBS处理和DC治疗组差异有显著性意义(P<0.01)。结论 DC疫苗可以有效控制荷人膀胱癌SCID鼠血循环肿瘤细胞微转移发生，进而延缓或阻止肿瘤转移。

【关键词】  树突状细胞 膀胱肿瘤 SCID鼠 免疫重建 微转移

　膀胱移行细胞癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，有明显的复发倾向，且大约16%-25%复发的肿瘤恶性程度增加[1]。浸润性膀胱癌患者往往在临床干预前就已经发生肿瘤细胞的微转移，导致约50%的浸润性膀胱癌患者即使手术切除原发肿瘤后仍死于转移。本研究以人化SCID鼠为模型，探讨DC疫苗对浸润性膀胱移行细胞癌血循环微转移转归的影响，旨在评估DC疫苗在杀灭循环中微转移的肿瘤细胞、进而控制肿瘤微转移方面的价值。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

　　1.1.1  实验动物及细胞株  C.B17SCID纯系小鼠30只，雌性，8-10周龄，(20.26±1.06)g，SPF级，购自上海斯莱克实验动物有限公司 (无免疫渗漏)。人浸润性膀胱癌细胞株T24，由北京医科大学泌尿外科研究所提供；鼠胚胎纤维母细胞株NIH3T3，购自中国科学院上海细胞库。

　　1.1.2  血源  新鲜人外周静脉全血采自本地中心血站AB血型健康供者，肝素钠抗凝，由山西省肿瘤医院输血科协助提供。

　　1.1.3  主要试剂  RPMI1640培养基(Cambrex)，胎牛血清(FCS)、人AB型血清(杭州四季青)，Trypsin(Amresco)，人淋巴细胞分离液(ρ=1.077) (TBD)，PBS(上海生工)，Millicell chamber(膜孔径为12μm)(Millipore)，Matrigel基质胶(北京医科大学病理教研室)，rhGMCSF、rhIL4、rhTNFα(PeproTech)，AntiasialoGM1抗体(Wako)，藻红蛋白(phycoerythrin, PE)标记的抗人CD1a、抗人CD80，异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)标记的抗人CD83、抗人CD4FITC/CD8PE/CD3PerCP单/多克隆抗体(BD)，Antihuman IgG ELISA试剂盒(BPB Biomedicals)，高保真即用PCR试剂盒、MMLVcDNA试剂盒(上海生工)。

　　1.2  方法

　　1.2.1  细胞准备  10%FCS的完全RPMI1640培养基(含青霉素100u/mL、链霉素100μg/mL)，置37℃、5%CO2(体积分数)孵育箱常规培养。0.25%Trypsin消化法收获对数增长期T24细胞，制成适当密度单细胞悬液备用；收集无血清培养24h的NIH3T3细胞培养基，制备NIH3T3细胞条件培养基备用。

　　1.2.2  T24细胞株高转移亚群筛选  参照Albini[2]等Boyden小室体外侵袭实验方法。Matrigel用无血清RPMI1640培养基1∶1稀释，每Millicell chamber 150μg加于膜上，紫外线照射过夜，用前浸于无血清RPMI1640培养基中，置37℃水化30min，即侵袭小室。筛选时取加有NIH3T3细胞条件培养基(0.6mL/孔)的24孔培养板，将侵袭小室放入24孔板中，小室内将T24细胞悬液(调整为106/mL)按0.2mL/孔加于膜上，37℃、5%CO2(体积分数)孵育箱培养7h后取出侵袭小室，留取贴附于24孔板内的细胞，10%FCS的完全RPMI1640培养基常规培养至传代。重复进行筛选共3次，完成3次筛选过程的子代细胞即具有高转移能力T24细胞亚群，记作T24-3。将T24-3细胞常规培养。

　　1.2.3  人化荷瘤SCID鼠自发转移模型构建实验  选取实验SCID鼠12只，于实验前1d进行NK细胞封闭：经尾静脉注射AntiasialoGM1，20μL/鼠。新鲜抗凝人外周静脉血200mL密度梯度离心法分离huPBL并用PBS调整浓度为8×107/mL；0.5mL(4×107个细胞)/鼠，经腹腔注射。同时设对照鼠6只。免疫重建后1d于鼠右后肢大腿内侧皮下注射接种3×106个T24-3细胞(0.1mL细胞悬液)，隔日观察成瘤和生长情况。于注瘤细胞后2、4、5、6周分别随机抽取3只，经眼球取血后处死，留取组织标本。未抗凝血分离血清后-80℃存放，ELISA法测定鼠血中人IgG含量；EDTA抗凝血分别采用FCM检测鼠血中人CD3+、CD4+、CD8+T细胞数目和RTPCR检测鼠血中人CK20 mRNA表达(CK20和对照GAPDH基因引物见表1)；脾脏称重后行鼠脾中人CD3+、CD4+、CD8+T细胞数量的FCM检测；将瘤体和肝、肺、骨等脏器组织10%(体积分数)甲醛固定，行病理学检查。

　　表1  CK20和GAPDH基因引物序列（略）

　　1.2.4  DC的诱导培养及致敏  新鲜抗凝人外周血40mL密度梯度离心法分离单个核细胞(PBMC)，无血清RPMI1640培养基调整浓度为2×106/mL；37℃、5%CO2(体积分数)孵育培养2h；留取贴壁细胞，含10%(体积分数)人AB型血清完全RPMI1640培养基和rhGMCSF、rhIL4(终质量浓度分别为1000ng/mL和20ng/mL)，37℃、5%CO2(体积分数)条件培养；培养第3天全量更换培养液并添加全量新鲜细胞因子；第5天加入rhTNFα(终浓度为500ng/mL)；第8天收获悬浮细胞。致敏DC为培养第3天更换培养液并添加细胞因子时以10∶1比例(DC∶肿瘤细胞)加入冻融法获得的T243细胞裂解上清液共培养。

　　1.2.5  DC疫苗对人化荷瘤SCID鼠血循环微转移转归的影响  另选取SCID鼠12只，随机分为PBS对照、DC和DC疫苗组，每组4只。行NK细胞封闭、huPBL腹腔转输和右后肢大腿内侧皮下接种T24-3制备干预模型。予右侧腹股沟皮下相应注射0.1mL PBS、0.1mL(106) DC和DC疫苗悬液，1次/周，干预2次后终止实验。经眼球取血后处死，留取组织标本。抗凝血RTPCR法检测鼠血中人CK20 mRNA表达，部分瘤体FQPCR法检测MMP7 mRNA表达(引物序列见表2)；其余瘤组织和脏器等行病理学检查。

　　表2  MMP7基因和Taqman探针引物序列（略）

　　1.2.6  FQPCR法检测MMP7 mRNA表达  Trizol抽提总RNA；逆转录合成cDNA；取逆转录产物12.5μL，加入引物各2.25μL、探针0.625μL、H2O 2.375μL和RNA 5μL，终体积为25μL，50℃ 2min→95℃ 10min，94℃ 15s→60℃ 1min，循环50次，自动荧光定量检测仪PCR PE7000检测，根据标准曲线得到各样本基因拷贝数/μL，以MMP7/GAPDH(内参照)的比值判定MMP7表达水平。

　　1.2.7  统计学处理  实验数据由SPSS13.0统计软件进行分析，采用完全随机方差分析、Dunnett检验、KruskalWallis秩和检验、Nemenyi法分析，实验结果用±s表示，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  T24细胞中高转移亚群的特性  经Boyden小室体外侵袭实验法筛选所得T24-3细胞的体外侵袭力较母代细胞强3.4倍。

　　2.2  T24-3细胞在SCID小鼠体内的成瘤性  于SCID小鼠体内接种T24-3细胞后100%成瘤，取瘤组织经病理检测结果显示为移行细胞癌(图1)；注瘤细胞后不同周次取小鼠肝、肺、骨等脏器组织未发现肉眼及病理学可见的转移灶。

　　图1  荷瘤SCID鼠模型 (A)及瘤体病理(B) HE×100（略）

　　2.3  人PBL于SCID小鼠体内的人化水平  将人PBL接种SCID小鼠体内后2周，小鼠血清中即可100%检测到人IgG，4周升高至峰值，5周仍存在一定水平，较对照组(11.79±4.63)μg/mL有显著性差异(P<0.01)。小鼠脾重随接种PBL时间的延长逐渐加重，6周达(189.7±56.2)mg，较对照组的(38.8±15.9)mg显著增加(P<0.01，表3)。于小鼠外周血和脾脏中均检测出人CD3+、CD4+、CD8+T细胞表型的表达，但对照组则未检测到(表4)。

　　表3  接种人PBL后SCID鼠血中人IgG和脾重情况（略）

　　*P<0.05, **P<0.01 vs. 对照组；△△P<0.01 vs.对照组

　　2.4  小鼠外周血细胞中CK20 mRNA表达  T24和T24-3细胞均为CK20 mRNA阳性表达(图2)；于小鼠体内接种T243细胞后，第2周、4周鼠外周血中均未检出CK20 mRNA的表达，5周、6周各检出2例CK20 mRNA的阳性表达。提示此时的鼠血循环中可能存在肿瘤细胞的微转移。

　　2.5  人外周血中DC的诱导和表型变化  人外周血PBL经体外诱导培养第5天，约得到(2.57±1.01)×106个DC；培养至第8天时可收获(3.12±1.30)×106个DC。细胞表型分析结果显示，培养至第8天时，获得的DC相对特异、成熟[特异标志CD1a表达率为(78.07±9.43)%，成熟标志CD83表达率为(46.82±14.15)%]。

　　表4  接种人PBL不同时间后SCID鼠体内人CD3+、CD4+、CD8+T细胞表型检测结果（略）

　　图2  SCID鼠外周血细胞和人膀胱癌细胞株(T24、T24-3)CK20 mRNA的表达（略）

　　2.6  荷瘤SCID小鼠血循环中肿瘤细胞微转移的转归  于SCID小鼠体内注射T24-3瘤细胞后5周、6周，分别用不同DC疫苗进行干预。干预后，各组小鼠的腹股沟、髂血管旁、肾蒂旁淋巴结和肺脏、肝脏转移情况及血循环中CK20 mRNA表达情况见表5。DC疫苗治疗组小鼠的瘤体组织中MMP7 mRNA表达值最低，与其他两组间差异有统计学意义(P<0.01，图3)。

　　表5  DC疫苗干预后各组小鼠外周血CK20 mRNA表达情况（略）

　　△1例双肺转移，2例髂血管旁淋巴结转移；#1 例肾蒂旁淋巴结转移

　　图3  DC疫苗干预后各组荷瘤小鼠瘤体MMP7mRNA表达（略）

　　**P<0.01 vs. PBS 处理组；ns：P>0.05 vs. DC 治疗组

　　3  讨论
   
　　浸润性膀胱癌经治疗后常预后不良，约半数患者死于肿瘤的转移，而目前对于肿瘤转移灶形成之前的微转移干预极为被动。肿瘤发生免疫逃逸除自身免疫功能缺陷外，更重要的是其主动诱导宿主的免疫耐受，导致宿主对肿瘤呈免疫无能状态[3]。Fung等 [4]在动物荷瘤模型中分离到CD8+DC，可以通过Fas/FasL途径诱导CD4+T细胞发生凋亡，最终导致肿瘤特异性T细胞免疫耐受，而有利于肿瘤细胞的生长。Almand等[5]研究发现，肿瘤组织中DC的抗原呈递功能低下，不能有效活化体内肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)，杀伤肿瘤细胞。因此，自肿瘤患者体内分离诱导的DC，经体外给予各种形式肿瘤抗原的修饰，被致敏激活成能激发特异性CTL反应的DC疫苗，回输宿主体内后，可纠正荷瘤宿主DC的功能缺陷，从而诱发或增强宿主对肿瘤的免疫应答，该策略已经成为多种肿瘤生物治疗的研究热点。
   
　　GaleaLauri等[6]在研究影响DC疫苗效应的不同因素时发现，抗原种类及负载方式更是影响DC疫苗效应的重要因素。本研究利用肿瘤细胞反复冻融获得的肿瘤裂解物为多价抗原，可能含有未被发现的重要肿瘤表位，可有效避免单价抗原因抗原表位缺失所致肿瘤逃逸；多价抗原负载于DC，还有可能诱导CTL效应多克隆放大，提高抗肿瘤作用[7]。
   
　　SCID鼠是异种移植的良好活体承载系统[8]，可以利用人类免疫细胞移植进行人性化，适于在动物体内研究人类免疫细胞对人类肿瘤的免疫反应。人化SCID鼠模型有望成为研究人类膀胱癌等肿瘤免疫治疗较为理想的动物模型。Mosier等[9]创建了人PBL腹腔转输SCID鼠进行人化实验。实验中将4×107个PBL经腹腔对SCID鼠进行免疫重建，并于不同时间观察小鼠体内人免疫状态(IgG水平和CD3+、CD4+、CD8+T细胞数量)及脾重，结果显示，实验组小鼠外周血中均出现人免疫细胞，实验组脾脏重量较对照组明显增加，显示出人化免疫状态，且至少维持6周。
   
　　微转移一般是指非血液系统的恶性肿瘤在发展过程中，播散并存活于淋巴系统、血循环、骨髓、肝、肺等组织器官中，肿瘤病灶直径1-2mm，同时伴随基质反应和新生血管形成，常无临床表现，常规检查方法如CT、MRI、单抗放显技术、普通病理检查等都难以发现。微转移是癌浸润与转移特征的重要参照指标，也是肿瘤复发与转移的基础和前提。细胞角蛋白(CK)是上皮细胞发生、分化、成熟过程中逐渐形成的，是所有哺乳动物细胞骨架中间丝之一。其中CK20具有更为严格的上皮组织特异性，仅限于肠道、尿路上皮和Merkel细胞，而正常血细胞中不表达。大量研究证实，CK20是膀胱肿瘤循环微转移存在的良好标志[1011]。本实验结果同样显示，在SCID小鼠体内注射瘤细胞后5周，外周血中检出CK20 mRNA阳性表达且相对稳定，提示循环中已发生肿瘤细胞微转移。该结果为后期干预时间的选择提供了依据。
   
　　研究结果显示，荷瘤SCID小鼠外周血中，DC疫苗治疗组无一检出CK20 mRNA阳性表达，且无1例发现远处器官转移；而PBS处理组中2例CK20 mRNA阳性表达，3例出现远处转移；DC治疗组小鼠的上述指标介于两者之间。该结果提示，DC疫苗干预对肿瘤治疗的近期疗效最好，可以有效减少或清除循环微转移的肿瘤细胞。此外，研究已经发现，基质金属蛋白酶(MMPs)与人类多种恶性肿瘤侵袭转移相关。MMP7作为基质降解素和基质溶解素样酶亚类的一员，可以降解层黏连蛋白、弹力蛋白和糖蛋白，而弹力蛋白是血管、淋巴管壁的主要成分[12]。Sumi等[13]检测20例膀胱移行细胞癌患者的肿瘤组织，均发现MMP7呈阳性表达，提示MMP7表达与肿瘤侵袭转移特性有关。本实验结果显示， MMP7 mRNA在不同DC疫苗干预组荷瘤小鼠瘤体中均有不同程度表达，PBS处理组中MMP7 mRNA表达值最高，DC疫苗治疗组表达最低，结合微转移标志物表达情况提示，DC疫苗干预至少可能部分削弱或抑制肿瘤细胞中具有较高侵袭转移能力肿瘤细胞亚群的活性或转移潜能，下调MMP7 mRNA表达，从而防止肿瘤转移。这也间接证实，DC疫苗可能促进血循环中微转移肿瘤细胞的良好转归，延缓或阻止转移灶形成，有望对临床中存在复发转移高危因素的肿瘤患者起到良好的治疗作用。但是，实验样本数量少和疗效观察时间短等问题尚需完善，DC疫苗应用方法标化等亟待解决。

【参考文献】
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　　[3]Ludmila M, Rolf K, Robert CR, et al. Escape mechanisms in tumor immunity: an update [J]. J Env Patho Toxicol Oncol, 2002, 21(4):277300.

　　[4]Fung L, Engleman EG. Dendritic cells in cancer immunotherapy [J]. Ann Rev Immunol, 2000, 18:245273.

　　[5]Almand B, Resser JR, Lindman B, et al. Clinical significance of defective dendritic cell differentiation in cancer [J]. Clin Cancer Res, 2000, 6(5):17551766.

　　[6]GaleaLauri J, Wells JW, Darling D, et al. Strategies for antigen choice and priming of dendritic cells influence the polarization and efficacy of antitumor Tcell responses in dendritic cellbased cancer vaccination [J]. Cancer Immunol Immunother, 2004, 53(11):963977.

　　[7]Vegh Z, Mazumder A. Generation of tumor cell lysateloaded dendritic cells preprogrammed for IL12 production and augmented T cell response [J]. Cancer Immunol Immunother, 2003, 52(2):6779.

　　[8]TaryLehmann M, Saxon A, Lehmann PV. The human immune system in huSCID mice [J]. Immunol Today, 1995, 16(11):529533.

　　[9]Mosier DE, Gulizia RJ, Baird SM, et al. Transfer of a functional human immune system to mice with severe combined immunodeficiency [J]. Nature, 1988, 335(6187):256259.

　　[10]Gudemann CJ, Weitz J, Kienle P, et al. Detection of hematogenous micrometastasis in patients with transitional cell carcinoma [J]. J Urol, 2000, 164(2):532536.

作者单位：山西省肿瘤医院泌尿外科，山西太原 030013