膀胱癌患者外周血树突状细胞免疫状态变化及其临床意义

【摘要】  目的 探讨膀胱癌患者外周血中树突状细胞(DC)的免疫功能状态变化及其与膀胱癌发生的关系。方法 检测15例临床确诊的中晚期膀胱癌患者外周血DC表面CD1a、CD83表达水平及免疫诱导T淋巴细胞增殖的能力，并与10名健康成人比较。结果 膀胱癌患者DC表面CD1a及CD83表达水平(分别为57.4±1.6，72.1±1.1)明显低于正常对照组(64.9±1.4，80.6±1.2，P<0.05)；其体外诱导T细胞增殖的能力亦明显低于正常对照组(P<0.05)。结论 膀胱癌患者DC存在免疫功能缺陷可能是膀胱癌逃避宿主免疫监视的重要原因之一。

【关键词】  树突状细胞；膀胱肿瘤；肿瘤免疫；免疫监视

      树突状细胞(Dendritic cell, DC)作为目前已知的功能最强的专职抗原递呈细胞(antigen presenting cell, APC)，能摄取、加工及递呈抗原，并能刺激初始型Ｔ细胞(naive T cells)的活化和增殖，启动机体的特异性免疫应答，从而在机体的抗肿瘤免疫中发挥重要作用[1]。越来越多的证据表明，DC数量减少或功能缺失将导致DC免疫功能低下或免疫无能(immuneanergy)，从而使DC不能充分激发Ｔ细胞产生免疫应答，甚至引起免疫耐受，造成了肿瘤的发生、发展和转移[2]。本实验拟通过检测膀胱癌患者外周血DC特异性标志CD1a、CD83表达水平及其体外诱导T细胞增殖的能力，探讨膀胱癌患者外周血中DC的免疫功能状态变化及其与膀胱癌发生的关系。

    1  材料与方法

    1.1  主要试剂和仪器  RPMI 1640细胞培养基购自GIBCO公司，特优级胎牛血清(FBS)购自Hyclone公司，人淋巴细胞分离液购自上海生化二厂，重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGMCSF)购自R&D公司，白细胞介素(IL)4购自Peprotech公司，FITCanti human CD1a和PEanti human CD83购自ebioscience公司，尼龙毛购自伊普瑞斯公司。

    1.2  病例选择  临床确诊的中晚期膀胱癌患者15例，男11例、女4例，平均年龄58.2岁，均未接受任何抗肿瘤治疗。健康成人10例作为正常对照组，男女各5例，平均年龄31.7岁。

    1.3  DC体外诱导培养和检测

    1.3.1  DC体外诱导培养  相同条件下无菌采取新鲜膀胱癌患者及正常对照组外周血15mL，PRMI 1640液等倍稀释后，沿管壁缓慢加入含有淋巴细胞分离液的离心管中，与淋巴细胞分离液体积比为2∶1。2500r/min离心20min后，小心抽出白膜层(单个核细胞)，加入2倍体积的1640液，混匀后1500r/min 10min、1000r/min 10min，去除血小板。用2mL完全培养基悬浮细胞，接种于用多聚赖氨酸特殊处理的培养皿中，37℃、5% CO2孵箱培养3h后，弃去培养上清，用37℃预热的1640培养液洗涤2次后，贴壁细胞为单核细胞。加入含20%(体积分数)胎牛血清的完全培养基、rhGMCSF终浓度为100ng/mL、IL4终浓度为50ng/mL，37℃、5%CO2孵箱培养，记为第0天，隔天半量换液，补充全量细胞因子。培养诱导7d的细胞为DC。

    1.3.2  倒置显微镜观察  观察DC生长过程中的形态学变化。

    1.3.3  免疫组化染色  吸取DC培养液100μL，滴于用多聚赖氨酸处理的载玻片上，自然晾干，丙酮酸固定，免疫组化SP法特异性染色，脱水、封片后光学显微镜观察。

    1.3.4  细胞表面标志物的检测  收集培养第7天的DC分为膀胱癌组及正常对照组，分别加CD1a及CD83，流式细胞仪上机检测。

    1.4  DC免疫功能检测

    1.4.1  T细胞分离纯化  无菌抽取膀胱癌患者及正常对照组外周血各4mL，分离出单个核细胞，方法同前。37℃、5% CO2 孵箱孵育2h后，吸取悬浮细胞，用温热1640培养液1000r/min离心10min，洗涤2次后，尼龙毛法分离出T淋巴细胞。

    1.4.2  DC诱导自体T淋巴细胞增殖反应  于16孔培养板中每孔加入5×103 DC(分别来自正常对照组及膀胱癌患者)和1×105 T淋巴细胞(与DC同源)，在5% CO2、37℃培养箱中培养56h后，加入3HTdR(3.7×104/孔)，继续培养至72h终止。收集细胞,采用液闪仪测定cpm值，按公式计算刺激指数(SI)。SI=(实验组cpm-本底cpm)/(对照组cpm-本底cpm)[3]。

    1.5  统计学处理  所有变量均用±s表示，利用SPSS 13.0软件进行统计学分析，采用配对t检验分析两变量间差异性。

    2  结    果

    2.1  DC的形态学改变  贴壁的单核细胞经培养18h后不再贴壁，诱导培养第2天细胞形态不规则，少量细胞开始聚集成簇，每簇3-5个不等，半悬浮生长。培养第4天可见悬浮细胞团数量增多，细胞体积增大、不规则，细胞周边可见毛刺状突起。培养第6天，悬浮细胞团开始散开，细胞体积较大，突起较长。培养第7天，细胞团散开，细胞完全悬浮，胞体呈圆形，均有较长突起，为典型DC形态(图1)。

    2.2  免疫组化特异性染色结果  细胞滴片后，免疫组化CD1a特异性染色可见DC胞体呈球形，体积较大，染成红棕色，细胞周边可见毛刺状突起(图2)。

    2.3  正常对照组及膀胱癌组CD1a和CD83的表达

    正常对照组贴壁的单核细胞经用rhGMCSF＋rhIL4诱导7d后，DC特异性标志CD1a的阳性表达率为69.61%(图3)；特异性成熟标志CD83的阳性表达率为85.31%(图4)。相同条件下膀胱癌组贴壁的单核细胞经rhGMCSF＋rhIL4诱导7d后，CD1a的阳性表达率为54.12%(图5)；CD83的阳性表达率为64.97%(图6)。

    2.4  DC免疫功能  膀胱癌患者较正常对照组DC表面CD1a和CD83表达水平明显降低，其差异有显著性(P<0.05)；其免疫诱导力亦明显低于正常对照组，差异有显著性(P<0.05，表1)。 表1  膀胱癌患者DC表面CD1a和CD83表达水平及其免疫诱导力的比较

    3  讨    论

    DC是目前已知功能最强的抗原提呈细胞。在体内，它经历从不成熟到成熟的发育过程。随着发育成熟，DC能表达一系列分化抗原，其中与其功能最直接相关的是CD1a、MHCI类分子、HLADR、CD80、CD83、CD86等[4]。DC在体内含量极少，研究及应用必须进行体外扩增，培养DC的前体细胞可来源于骨髓、脐血和外周血，其中利用外周血的单核细胞作为前体细胞，取材方便，培养体系稳定，便于临床应用。本研究在相同条件下对膀胱癌患者及正常对照组的外周血单核细胞进行诱导，培养第7天收获DC，利用光学显微镜和免疫组化染色观察细胞形态，见DC体积较大，呈圆形，形态较规则，细胞周边有明显较长突起。这一形态特征与DC的功能有密切关系，这使其能有效地摄取抗原并选择性地作用于体内数量极少的抗原特异性淋巴细胞，从而发挥抗原提呈的作用。

    目前，国内外鉴定DC主要采用CD1a和CD83分子，Coventry等[5]认为CD1a主要表达于人胸腺细胞、树突状细胞(包括Langerhans细胞)，是鉴定人外周血与骨髓中DC的最好标记。Prechtel等[6]研究发现CD83是DC的成熟标志，在DC培养早期不表达CD83分子，当成熟时才表达CD83分子。所以目前主要用CD1a阳性细胞的多少来反映DC的数量，CD83表达的水平来反映树突状细胞的成熟度。本研究发现，与正常对照组比较，膀胱癌患者外周血来源的DC，CD1a和CD83的表达水平均较低(P<0.05)，其DC诱导免疫能力亦低下(P<0.05)。说明膀胱癌患者DC数量少且多数处于不成熟状态，因而递呈抗原的能力较差，不能有效地启动机体免疫应答，从而导致膀胱癌的免疫逃逸。至于DC数量减少以及功能成熟缺陷的可能机制，有实验研究证明：①癌细胞可诱发DC的凋亡，从而导致DC在肿瘤微环境中的数量下降[2]；②肿瘤细胞分泌的血管内皮生长因子，可于造血前体细胞水平抑制DC而导致荷瘤宿主DC的数量减少[7]；③肿瘤分泌的其他因子，如IL10可以抑制DC的分化成熟，下调共刺激分子的表达，并可抑制DC在肿瘤内的聚集[8]，TGFβ可显著抑制DC的产生和DC的分化成熟[9]。因此推测膀胱癌患者外周血中可能存在上述抑制DC免疫功能的细胞因子。而该类因子可能来源于肿瘤细胞 ,通过减少DC数量，抑制DC成熟从而抑制DC的免疫功能。肿瘤逃避宿主免疫监视的一个重要原因是宿主抗肿瘤免疫无能，而肿瘤患者DC免疫功能低下则可能是肿瘤逃避宿主免疫监视的重要机制。如能增加DC数量并促进膀胱癌患者DC的成熟，将有助于恢复并增强DC的免疫学功能，从而恢复并增强宿主对膀胱癌的免疫力。

    综上所述，膀胱癌患者由于DC数量少及DC功能缺陷使得肿瘤抗原无法被有效提呈，影响DC的抗原提呈能力，因而无法诱导肿瘤特异性杀伤性T细胞反应，最终导致膀胱癌的免疫逃逸。提示临床上可以通过使用DC疫苗或者其他手段增加肿瘤内成熟DC数量与活性，从而有效地提呈肿瘤抗原，提高机体对肿瘤的免疫杀伤力。

【参考文献】
  [1]Inaba K, Pack M, Inaba M, et al. High levels of a major histocompatibility complex Ⅱself peptide complex on dendritic from the T cell areas of lymph node [J]. J Exp Med, 1997, 186(5):665672.

[2]Pirtskhalaishvili G, Shurin GV, Gambotto A, et al. Transduction of dendritic cell with BclxL increases their resistance to prostate cancerinduced apoptosis and antitumor effect in mice [J]. J Immunol, 2000, 165(4):19561964.

[3]Chen L, Linsley PS, Hellstrm KE. Costimulation of T cells for tumor immunity [J]. Immunol Today, 2003, 14(10):483486.

[4]Figdor CG, de Vries IJ, Lesterhuis WJ, et al. Dendritic cell immunotherapy: mapping the way [J]. Nat Med, 2004, 10(5):475480.

[5]Coventry BJ, Austyn JM, Chryssidis S, et al. Identification and isolation of CD1a positive putative tumour infiltrating dendritic cells in human breast cancer [J]. Adv Exp Med Biol, 1997, 417:571577.

[6]Prechtel AT, Steinkasserer A. CD83: an update on functions and prospects of the maturation marker of dendritic cells [J]. Arch Dermatol Res，2007, 299(2):5969.

[7]Ohm JE, Shurin MR, Esche C, et al. Effect of vascular endothelial growth factor and FLT3 ligand on dendritic cell generation in vivo [J]. J Immunol, 1999, 163(6):32603268.

[8]Girolomoni G, RicciardiCastagnoli P. Dendritic cells hold promise for immunotherapy [J]. Immunol Today, 1997, 18(3):102104.

[9]张毅，武汉磐，张雁云，等. 转化生长因子β对鼠造血祖细胞产生树突状细胞的调控作用[J]. 中华医学杂志, 1999, 79(3):178180.(编辑 邱 芬)

作者单位：(1. 新疆石河子大学医学院；2. 新疆石河子大学医学院第一附属医院泌尿外科，石河子 832000)