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【摘要】 目的 观察中药宝宝乐口服液对瘦素调节下丘脑腹内侧区(VMH)神经元mIPSC的影响。方法 利用红外可视脑片膜片钳技术记录对照组、模型组和治疗组3组实验大鼠VMN神经元的mIPSC，取给药前1 min和给药最后1 min的数据，分析瘦素及宝宝乐口服液对mIPSC频率的影响。结果 瘦素使3组大鼠大部分VMN神经元的mIPSC频率减少，小部分VMN神经元的mIPSC频率增加。mIPSC频率抑制或增加的程度在3组间无显著性差异(P>0.05)，但模型组mIPSC频率抑制的神经元比例显著多于对照组(P<0.05)，而mIPSC增加的神经元显著少于对照组(P<0.05)，且模型组mIPSC对瘦素无反应的神经元比例也减少；治疗组中mIPSC频率抑制或增加的程度恢复正常。结论 厌食模型动物VMN对瘦素的整体敏感性增加，使VMN发出过度的饱信号，从而产生厌食；宝宝乐口服液可以纠正和改善这一病理过程，这应当是小儿厌食发生发展及运脾复方作用的中枢机制之一。
【关键词】 宝宝乐口服液；微小抑制性突触后电流；下丘脑腹内侧核；膜片钳
小儿厌食是常见的摄食行为异常，对儿童生长发育影响较大，而对小儿厌食发生发展及其特效疗法的深入研究将有助于推动人类对摄食生理调控机制的进一步认识和提高儿童健康水平[1]。近20年来，国内学者广泛使用以恢复脾胃运转之机，使脾胃调和、脾运复健为主要目的的运脾法为治则，治疗小儿厌食取得很好疗效，并系统研究了运脾法对消化吸收功能的影响，在外周水平上证实运脾法对胃肠道的运动和分泌有显著的调节作用[2]。在以往的研究中，我们采用病因模拟法成功地制作了幼龄大鼠厌食模型[3]，并就运脾复方对该模型中枢和外周胃肠激素的调节作用[4]、对厌食大鼠下丘脑腹内侧核（ventromedial hypothalamic nuclui，VMN）神经元外周摄食负反馈信息的敏感性的影响进行了研究，取得了一些成果[5]。为进一步探讨小儿厌食症的发病机制和运脾复方的作用机制，我们观察了运脾复方宝宝乐口服液对瘦素调节VMN微小抑制性突触后电流（minute inhibitory postsynaptic current，mIPSC）的影响。
1材料与方法
1.1 动物及分组日龄35~40 d的SD大鼠45只，质量(60±10) g（第四军医大学实验动物中心提供），随机分为对照组、模型组和治疗组，每组15只。所有动物均单笼饲养，自由进食水。
1.2模型制备和药物治疗按文献[3] 制作厌食大鼠模型。即用正常鼠饲料喂养对照组大鼠，用特制饲料喂养模型组和治疗组大鼠。1周后特制饲料喂养的大鼠日摄食量下降30 %以上、体重下降15 %以上，表明模型制备成功。从实验第8 d开始，治疗组大鼠用运脾复方宝宝乐口服液(苍术、焦山楂、黄芪、党参、陈皮各10 g,白芍、决明子、煅龙骨、煅牡蛎各20 g，第四军医大学西京医院药剂科提供）灌胃，每日1次，剂量为37.6 g/kg(为临床等效剂量的2倍)，同时给予对照组和模型组大鼠等容积生理盐水灌胃，连续3周。
1.3膜片钳记录大鼠腹腔注射10 %水合氯醛（3.3 mL/kg），麻醉后断头取脑，迅速置于充以95 ％O2和5 ％CO2人工脑脊液（artificial cerebrospinal,ACSF）的冰水混合物中，1 min后取出修块，在4 ℃、95 ％O2和5 ％CO2混合气体条件下，移至振动切片机切出含VMN在内的200 μm的冠状脑片，置入28 ℃持续充氧的ACSF中孵育1 h，ACSF成分（mmol/L）：NaCl 126，KCl 2.5，Na2HPO4 1.2，NaHCO3 24，Glucose 11.1，MgSO4 1.2，CaCl2 2.4（pH 7.2~7.4，渗透压299 mOsm）。然后在正置纤维镜（Axoskop I；Zeiss，Thornwood，NY）水浸镜头下进行可视膜片钳记录，膜片钳放大器使用MultiClamp700B（Axon Instruments，American）。用pClamp8软件（Axon Instrument，Foster City，CA）来记录和分析数据。记录mIPSC使用的电极内液成分(mmol/L)：KCl 57，Kgluconate 70，NaCl 20，MgCl2 1.5，EGTA 0.1，Phosphocreatine 10，ATPMg 2，GTPNa 0.5，HEPES 5（pH 7.3，渗透压280 mOsm）。在含钠通道阻断剂tetrodotoxin（TTX，1 μmol/L）、谷氨酸受体阻断剂6|cyano|7|nitroquinoxline|2,3|dione（CNQX，20 μmol/L）和D|（|）|2|amino|5|phosphonopentanoic acid（AP5，25 μmol/L）的ACSF灌流下，于钳制电压-70 mV记录VMN神经元的mIPSC，取给药前1 min和给药最后1 min的数据，分析瘦素对mIPSC频率的影响。用Axograph软件(Molecular Devices，Union City，CA)分析mIPSC频率的改变。实验用所有的化学试剂和药理试剂均购自Sigma公司。
1.4统计学处理实验数据采用均数±标准差(±s)表示，采用t检验和χ2检验。
2结果
在含TTX、AP5和CNQX的细胞外液灌流下记录了对照组（n=18,n：神经元数，下同）、模型组（n=21）和治疗组（n=21）VMN神经元的mIPSC，瘦素使大部分VMN神经元的mIPSC频率减少[图1A（a）]、小部分VMN神经元的mIPSC频率增加[图1A（b）]。mIPSC频率抑制或增加的程度3组间无显著性差异（图1B），但模型组mIPSC频率抑制的神经元比例显著多于对照组，而mIPSC频率增加的神经元显著少于对照组，模型组mIPSC对瘦素无反应的神经元比例也显著减少（图1C）。提示模型组VMN神经元对瘦素的敏感性增强，被瘦素触发产生动作电位的可能性增加，而宝宝乐口服液能降低瘦素对VMN神经元mIPSC的抑制作用，从而使VMN神经元发放动作电位的可能性降低。图1瘦素对3组大鼠VMN神经元mIPSC的影响
注：1.A（a）示瘦素使一个神经元的mIPSC显著减少，A（b）示瘦素使另一个神经元的mIPSC显著增加；B示各组神经元mIPSC频率的增加或减少有显著性差异(与瘦素灌流前比较*P<0.05，与瘦素灌流后比较#P<0.05)，但增加或减少的幅度各组间无显著性差异；C示各组大鼠VMN神经元在灌流瘦素时mIPSC减少、增加和无变化的细胞数的构成比。2.C中与对照组比较*P<0.05。3讨论目前，厌食已经成为儿科临床的常见疾病之一，对儿童的生长发育影响较大，发病机制尚不明确，西医至今仍未发现特效的疗法。国外流行病学调查提示，婴儿和学龄前儿童进食问题（包括拒食和偏食）的发生率约为12 %～34 ％，治疗多以合理喂养和心理引导为主[6]。国内研究集中在消化功能紊乱、微量元素缺乏和免疫功能低下等方面，取得了一些成果[1-2]。中医药治疗本病有独特的优势，其中运脾法[7]经过20多年大量的临床观察，证实该法治疗小儿厌食症有着可靠的疗效。近年来，我们发现该模型下丘脑和外周CCK 等多种与摄食控制相关的脑肠肽水平异常[4]，食欲中枢——下丘脑外侧区和下丘脑腹内侧区神经元自发放电频率改变[5]；临床治疗小儿厌食有可靠疗效的运脾复方不仅可调节外周血中与摄食有关的肽类激素水平,而且能调节下丘脑食欲中枢神经元的自发放电频率[4-5] 。提示该造模因素可能使VMN发出过度的饱信号，从而引起动物摄食量下降，运脾复方能降低单个神经元的自发放电频率，从而抑制VMN发出的饱信号。VMN是摄食控制环路中的一个重要核团，刺激VMN终止动物摄食，而毁损VMN导致动物过食而肥胖，因此VMN被称为饱中枢[8]。瘦素是由脂肪细胞释放入血液的一种激素，直接作用于下丘脑神经元参与摄食调节，瘦素水平升高抑制摄食行为，瘦素水平降低刺激摄食行为[9]。据此，我们推测厌食大鼠VMN神经元兴奋性的改变及运脾复方的调节作用可能与瘦素的影响有关。本结果表明，50 %VMN神经元的mIPSC在瘦素灌流时被抑制，而22.2 %VMN神经元的mIPSC在瘦素作用下增多，还有27.8 %的VMN神经元的mIPSC对瘦素灌流无反应。这意味着只有一半的VMN神经元在瘦素作用下发放电活动的可能性增加，可能在摄食调节环路中发出饱信号。而另一半VMN神经元发放电活动的可能性减少或无变化。这一比例在模型组大鼠中被破坏，在治疗组中又恢复正常。提示该造模因素可能提高VMN对瘦素的整体敏感性，使VMN发出过度的饱信号，从而产生厌食；运脾复方宝宝乐口服液可以纠正和改善这一病理过程，这应当是小儿厌食发生发展及运脾复方作用的中枢机制之一。
【参考文献】
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[3]杜永平,张月萍,汪受传,等. 小儿厌食症动物模型的再研究[J].山西医科大学学报,2000,31(5):401-402.
[4]Du Y P,Zhang Y P,Wang S C,et al.Function and regulation of cholecystokinin,beta\|endorphin and gastrin in anorexic infantile rats treated with ErBao Granules[J]. WJ G,2001,7(2)：275-280.
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[8]张月萍，王建军.摄食控制的神经体液机制研究进展[J].中国神经科学杂志, 2001,17(4):350-353.
[9]Abhiram Sahu.Leptin signaling in the hypothalamus: emphasis on energy homeostasis and leptin resistance[J].Frontiers in Neuroendocrinology,2004,(24):225-253.
作者单位：1.第四军医大学西京医院，陕西 西安 710032; 2.甘肃中医学院，甘肃 兰州 730000