瘦素对幼龄厌食大鼠VMN神经元膜电位改变的影响

【摘要】  目的:观察瘦素对幼龄厌食大鼠下丘脑腹内侧核(VMN)神经元膜电位的影响。方法:利用红外可视膜片钳技术记录对照组、模型组两组动物VMN神经元的膜电位，分析瘦素对VMN神经元膜电位的影响。结果:瘦素使两组动物大部分神经元去极化，组间比较无显著性差异。少数VMN神经元在瘦素作用下超极化，组间比较亦无显著性差异。然而，模型组VMN神经元的膜电位被瘦素去极化而导致自发放电增加的细胞比例增多，被瘦素超极化而自发放电减少的细胞比例减少，对瘦素无反应的细胞比例也减少。结论:造模因素可能通过提高VMN对瘦素的整体敏感性，使VMN发出过度的饱信号，从而产生厌食，这应当是小儿厌食发生发展的中枢机制之一。

【关键词】  幼龄厌食大鼠；下丘脑腹内侧核；膜片钳；膜电位

     小儿无明显原因长期厌食的发病机制尚不十分清楚［1］ 。在以往的研究中，我们模拟小儿厌食症的主要病因,成功地制作了幼龄大鼠厌食模型［2］ ，并发现厌食大鼠下丘脑腹内侧核（ventromedial hypothalamic nuclui，VMN）神经元对外周摄食负反馈信息的敏感性增强［3］ ，提示VMN可能发出过度的饱信号，从而引起动物摄食量下降。本研究通过观察瘦素对厌食大鼠VMN神经元膜电位的改变，进一步证实了这一设想。

    1材料与方法

    1.1  材料

    日龄35~40 d的SD大鼠30只，质量(60±10)g（第四军医大学实验动物中心提供），随机分为对照组和模型组2组，每组15只。所有动物均单笼饲养，自由进食水。

    1.2方法

    1.2.1  模型制备和药物治疗

    按文献［2］方法制做厌食大鼠模型。即用正常鼠饲料喂养对照组大鼠，用特制饲料喂养模型组大鼠。1周后模型组大鼠日摄食量下降30 %以上、身体质量下降15 %以上，表明模型制备成功。

    1.2.2  膜片钳记录

    造模成功后，大鼠腹腔注射10 %水合氯醛（3.3 mL/kg）,麻醉后断头取脑，迅速置于冰水混合的细胞外液［NaCl 126、KCl 2.5、Na2HPO4 1.2、NaHCO3 24、Glucose 11.1、MgSO4 1.2、CaCl2 2.4(单位mmol/L)，pH 7.2～7.4，渗透压浓度299 mOsm］中充氧（95 %O2和5 %CO2，下同）1 min，移至振动切片机（机槽内注满持续充氧的冰水细胞外液）做200 μm厚的横切面脑片，置入28 ℃持续充氧的细胞外液中孵育1 h，然后在正置纤维镜（Axoskop I；Zeiss, Thornwood，NY）水浸镜头下进行可视膜片钳记录，膜片钳放大器使用MultiClamp 700B（Axon Instruments，美国）。用patch|clamp8软件（Axon Instrument，Foster City，CA）记录和分析数据。

    全细胞记录（whole cell patch）使用的电极内液成分(单位mol/L)为：K|gluconate 132.3、NaCl 4、CaCl2 0.5、Hepes 10、EGTA 5、ATP|Mg 4、GTP|Na 0.5、Phosphocretin 10(pH 7.2～7.3，渗透压280 mOsm),充灌电极后的电极电阻为6～8 MΩ。电极尖端与细胞膜形成高阻封接（达1～10 GΩ），然后吸破细胞膜，在电流钳gapfree状态下持续记录膜电位，观察瘦素（Leptin，50 nmol/L）对VMN神经元膜电位的影响，取给药前5 min的基础膜电位与给药最后1 min的膜电位进行比较。

    所有的化学试剂和药理试剂均购自Sigma公司。

    1.2.3  统计学处理

    实验数据采用均数±标准差(±s)表示,采用t检验和χ2检验。

    2结果

    在对照组（n=15,n：神经元数，下同）和模型组（n=15）大鼠脑片上观察了瘦素对VMN神经元膜电位的影响。瘦素使大部分神经元去极化（图1A），膜电位改变为对照组(5.01±1.23) mV（n=8），模型组(4.94±0.76) mV（n=13），两组间比较无显著性差异。少数VMN神经元在瘦素作用下超极化（图1B），膜电位改变为对照组(4.16±0.72) mV（n=3），模型组4.85 mV（n=1），两组间比较亦无显著性差异。然而，模型组VMN神经元的膜电位被瘦素去极化而导致自发放电增加的细胞比例增多，被瘦素超极化而自发放电减少的细胞比例减少，对瘦素无反应的细胞比例也减少（图1C），表明瘦素使模型大鼠VMN神经元的兴奋性增强。图1瘦素对实验大鼠VMN神经元膜电位的影响

    注：A示瘦素使一个VMN神经元去极化，自发放电显著增加，停止灌流瘦素后膜电位未恢复；B示瘦素使另一个VMN神经元超极化，自发放电消失，停止灌流瘦素后膜电位基本恢复；C示两组大鼠VMN被灌流瘦素去极化、超极化和无反应的神经元构成比,与对照组比较*P<0.05。

    3讨论

    目前，厌食已经成为儿科临床的常见疾病之一，对儿童的生长发育影响较大，发病机制尚不明确，西医至今仍未发现特效的疗法。国外流行病学调查提示，婴儿和学龄前儿童进食问题（包括拒食和偏食）的发生率约为12 %～34 ％，治疗多以合理喂养和心理引导为主［4］ 。国内研究主要集中在消化功能紊乱、微量元素缺乏和免疫功能低下等方面，取得了一些成果［1，5］ 。

    VMN是摄食控制环路中的一个重要核团，刺激VMN终止动物摄食，而毁损VMN导致动物过食而肥胖，因此VMN被称为饱中枢［3］ 。瘦素是由脂肪细胞释放入血液的一种激素，直接作用于下丘脑神经元参与摄食调节，瘦素水平升高抑制摄食行为，瘦素水平降低刺激摄食行为［6］ 。据此，我们推测厌食大鼠VMN神经元兴奋性的改变可能与瘦素的影响有关。

    研究表明［7］ ，膜电位的变化直接影响神经元动作电位的发放。本研究结果显示，瘦素对VMN神经元膜电位的影响存在三种情况——去极化、超极化和无反应。去极化的VMN神经元比例在模型组显著增加，超级化的VMN神经元在模型组显著减少，表现出对瘦素的敏感性增强。模型组VMN神经元对瘦素的敏感性并不表现在单个神经元对瘦素反应的强烈程度上，如膜电位去极化的幅度，而是表现为瘦素引起去极化的细胞数量的增加，同时使相反反应和无反应的细胞数减少，似乎是VMN神经元群对瘦素反应的不同模式在模型组进行了重新组合，说明大鼠VMN神经元对瘦素的不同反应存在着合理的比例关系，虽然大部分神经元在瘦素作用下电活动变得活跃起来，但却有一小部分神经元的电活动反而被抑制了，即使是那部分对瘦素无反应的神经元也具有潜在的调节功能。也许正是由于后两种情况的存在，才能使VMN灵活机动地发放饱信息，本实验造模因素可能是通过对这一比例关系的改变而影响动物的摄食量。也就是说，该造模因素可能通过提高VMN对瘦素的整体敏感性，使VMN发出过度的饱信号，从而产生厌食，这应当是小儿厌食发生发展的中枢机制之一。

【参考文献】
  ［1］张月萍,杜永平,汪受传,等. 小儿厌食发生发展及运脾法作用中枢机制研究的新思路［J］. 中国中医基础医学杂志, 1998 , 4(4) :18.

［2］杜永平,张月萍,汪受传,等. 小儿厌食症动物模型的再研究［J］.山西医科大学学报, 2000 , 31 (5) :401-402.

［3］杜永平,张月萍,张国成.儿宝颗粒对厌食大鼠下丘脑外侧区神经元整合摄食相关信息的影响［J］.中国中西医结合杂志，2005，25（11）：996-999.

［4］金明星译.婴儿和学龄前儿童进食问题的原因和治疗［J］.国外医学·妇幼保健分册，1995,6（3）：106.

［5］汪受传,尤汝娣,郁晓维, 等. 运脾方药治疗小儿厌食症的临床及实验研究［J］.中西医结合杂志, 1991,11 (2) :75-78.

［6］Abhiram Sahu. Leptin signaling in the hypothalamus: emphasis on energy homeostasis and leptin resistance［J］.Frontiers in Neuroendocrinology, 2004, 24:225-253.

［7］Chen Q, Pan H L. Regulation of synaptic input to hypothalamic presympathetic neurons by GABAB receptors［J］.Neuroscience, 2006,in press.

作者单位：1.第四军医大学西京医院，陕西 西安 710032;2.甘肃中医学院，甘肃 兰州 730000