抗端粒酶M1RNA核酶真核表达载体构建及肝癌细胞转染的研究

　　［摘要］  目的  构建抗人端粒酶RNA（hTR）的M1RNA核酶的真核表达载体，并筛选稳定转染核酶的肝癌细胞株。方法  设计并应用PCR技术合成hTR模板的M1RNA核酶，应用pEGFPC1载体构建M1RNA核酶的真核表达质粒，应用脂质体LipofectAMINEAM2000转染肝癌细胞系HepG2，应用G418筛选稳定表达核酶的细胞株。结果  测序证实hTR的M1RNA核酶基因被正确克隆入真核表达载体pEGFPC1，应用脂质体成功转染肝癌细胞系HepG2。结论  成功构建了hTR的M1RNA核酶，并筛选出了稳定表达核酶的肝癌细胞株。

　　［关键词］  M1RNA核酶；端粒，末端转移酶；肝癌细胞；转染

　　CONSTRUCTION OF EUKARYOTIC VECTOR OF M1RNA RIBOZYME AGAINST TELOMERASE RNA AND TRANSFECTION TO HEPATOCELLULAR CARCINOMA CELL LINES

　　JIANG YINGJUN, CHENG GUANG, KONG XINJUAN, et al

　　(Department of Emergency General Surgery,  The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China)
 
　　［ABSTRACT］ObjectiveTo construct a eukaryotic expression vector of M1RNA ribozyme against telomerase RNA and transfect to hepatocellular carcinoma cell lines. MethodsM1RNA ribozyme targeting the RNA template of telomerase was designed. The eukaryotic plasmids of M1RNA ribozyme were constructed using pEGFPC1 vector. The plasmids were introduced into hepatocellular carcinoma cells (HepG2) by LipofectAMINEAM2000. ResultsThe eukaryotic expression vector of M1RNA ribozyme against telomerase RNA was constructed successfully by sequencing analysis. The hepatocellular carcinoma cell lines HepG2 was transfected successfully by M1RNA ribozyme that targeted the RNA component of telomerase. ConclusionThe stable transfected cells with M1RNA ribozyme is constructed successfully.

　　［KEY WORDS］M1RNA ribozyme; telomerase; hepatocellular carcinoma cell; transfection
   
　　端粒酶是一种核糖蛋白酶，由端粒酶相关蛋白、端粒酶催化亚单位和RNA组分抗人端粒酶RNA（hTR）组成，端粒酶与肿瘤细胞永生化和肿瘤组织无限增生有密切关系，以端粒酶为靶点的肿瘤基因治疗已成为肿瘤研究领域的热点［1,2］。核酶是一种具有催化活性的小分子RNA，能序列特异性切割靶RNA。RNase P是由RNA和蛋白质辅助因子共同组成的核酶，具有异体剪切的特性，而M1RNA则是RNase P的活性亚单位。在镁离子存在下，在内部引导序列作用下，M1RNA可识别底物并发生切割作用。本文设计针对端粒酶RNA模板的M1RNA核酶，构建其真核表达载体，并应用脂质体转染肝癌细胞，为M1RNA核酶对肝癌细胞端粒酶活性的抑制作用研究打下基础。

　　1  材料与方法

　　1.1  细胞系

　　人肝癌细胞系HepG2购自武汉大学细胞库，细胞在37 ℃体积分数0.05的CO2条件下培养。培养基为DMEM，含体积分数0.10的胎牛血清、青霉素105U/L及链霉素105U/L，每2 d换液一次，每周1∶3传代2次。

　　1.2  试剂

　　含有M1RNA核酶的质粒由华中科技大学同济医学院郭容博士惠赠；含有绿色荧光蛋白的质粒pEGFPC1（Promega公司产品）由同济医科大学孔心涓惠赠；大肠杆菌E.coli DH5α由同济医科大学附属同济医院实验设备中心保存；各种限制性内切酶，T4DNA连接酶及DNA Marker均为日本TaKaRa公司产品。DMEM、青链霉素、小牛血清、琼脂糖为Gibco公司产品；胶回收试剂盒购自华美生物工程公司；脂质体LipofectAMINEAM2000购自Promega公司；其余实验所用试剂均为国产分析纯。

　　1.3  M1RNA核酶的设计与合成    设计针对端粒酶RNA模板5′CUAACCCUAAC 3′的M1RNA核酶，M1RNA核酶有ACCAC 5个碱基，一旦识别这5个碱基，核酶便开始切割反应。应用含M1RNA核酶的质粒，设计引物用PCR仪扩增出针对端粒酶RNA模板的M1RNA核酶，PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳，小量胶回收试剂盒回收备用。引物序列如下：上游引物为 5′GCGAATTCTAATACGACTCACTATAG 3′；下游引物为 5′CGGTCGACATTGGGATTGACTCTATGACCATGATT 3′，引物两端带有SalⅠ和EcoRⅠ的酶切位点（GTCGAC和GAATTC），便于克隆操作，引物由上海生工生物技术公司合成。设计结果如下：箭头表示核酶的切割部位。ATTGGGATTGACTCM1RNA核酶 5′  5′ GCCUUUUUUGUCUAACCCUAACUGAG 3′↓  端粒酶RNA模板ACCAC

　　1.4  M1RNA核酶真核表达质粒的构建

　　真核表达载体pEGFP用SalⅠ和EcoRⅠ双酶切，10 g/L琼脂糖凝胶电泳，小量胶回收试剂盒回收。将PCR扩增的M1RNA核酶克隆入pEGFP的酶切位点SalⅠ和EcoRⅠ中，转化E.coli DH5α，提取质粒并随机挑选克隆酶切产物初步鉴定，DNA测序仪分析所合成的序列，命名为phTRM1RNA。

　　1.5  细胞转染及筛选

　　质粒小量抽提试剂盒提取的质粒用酚氯仿抽提，紫外线分光光度仪定量，准备转染。用脂质体LipofectAMINEAM2000进行肝癌细胞转染，具体操作按照试剂盒说明书进行。转染核酶的HepG2细胞加400 mg/L的G418，筛选15 d，成功转染的细胞表达绿色荧光蛋白，筛选的单克隆细胞继续在含100 mg/L的G418的DMEM培养基中培养，以便检测核酶在细胞内表达情况及对肝癌细胞端粒酶活性的抑制作用。

　　2  结果

　　2.1  M1RNA核酶的鉴定

　　应用PCR从含有M1RNA核酶的质粒中扩增出针对端粒酶RNA组分的M1RNA核酶，PCR产物长应为420 bp，用10 g/L琼脂糖凝胶电泳证明结果正确，Marker为1 000 bp，结果如图1所示。

　　2.2  真核重组质粒pEGFPM1RNA的鉴定

　　用SalⅠ和EcoRⅠ双酶切真核表达质粒LipofectAMINEAM2000，切出长500 bp的片段，电泳结果证明克隆正确，如图2所示。

　　2.3  脂质体介导的肝癌细胞转染

　　应用脂质体LipofectAMINEAM2000成功地将真核表达质粒pEGFPM1RNA转染肝癌细胞HepG2，应用G418筛选稳定表达的细胞，成功转染的细胞表达绿色荧光蛋白，如图3所示。

　　图1  hTR的M1RNA核酶的PCR结果鉴定（略）

　　M为Marker，①为挑选的克隆

　　图2  真核重组质粒pEGFPM1RNA的酶切鉴定图谱（略）

　　M为Marker，①~③为挑选正确的克隆

　　图3  稳定表达pEGFPM1RNA的肝癌细胞（略）
　　
　　3  讨论

　　端粒酶是一种特殊的逆转录酶，以端粒的3′端为引物，自身的RNA组分为模板，从头合成端粒以修补细胞分裂时端粒的缩短。 端粒酶的RNA亚基是合成端粒DNA的模板，同时也具有催化功能，故对端粒酶的结构和催化活性至关重要。获得永生性是肿瘤细胞具有无限增殖能力的基础，也是细胞恶变的关键。永生化细胞继续分裂必须维持端粒的长度，故应有很强的端粒酶的活性表达［3,4］。很多研究证明，多种恶性肿瘤组织或细胞中有端粒酶的高表达（约84％~95％），而除生殖细胞以外的正常人体组织大多为端粒酶阴性，因此端粒酶在肿瘤研究领域受到高度重视，成为肿瘤基因治疗的新靶点。

　　核酶是一类具有生物催化活性的RNA分子，又称催化RNA ，核酶作为一种新的基因治疗手段近年发展迅速，在研究基因调控、病毒复制和灭活癌基因方面有很大的应用潜力。6种天然存在的核酶结构已经得到鉴定，分别是第一内含子、第二内含子、锤头状核酶、发夹状核酶、斧头状核酶和RNase P。其中RNase P是一个由RNA和蛋白质辅助因子共同组成的核酶，具有异体剪切的特性，切割前体tRNA分子（pretRNA）和一些小RNA分子的5′端前导序列，M1RNA是RNase P的活性亚单位，是真正具有催化活性的基团［5,6］。M1RNA在体外即具有催化活性，它与自然底物之间的相互作用依赖于对底物结构的识别，而不是某些特殊的序列或核苷酸，这一点与其他类型的核酶不一样。能被M1RNA识别的底物结构单元包括：①双链RNA区域（类似于pretRNA的氨酰基或T茎）；②5′端前导序列上4~16个的配对碱基和至少1个的突出碱基；③3′端未配对的CCA序列。任何给定的RNA序列如果能够提供这些结构要求，均可作为M1RNA核酶的靶基因［7~9］。另外，M1RNA核酶自发现以来，主要用于嵌和基因及突变基因所致疾病的治疗，例如导致慢性粒细胞性白血病的融合基因BCRABL，显示良好的应用前景，为白血病的治疗带来了新的希望［10］。本实验根据RNase P原理设计并合成了hTR的M1RNA核酶，应用含有绿色荧光蛋白的载体构建了其真核表达载体，并成功筛选稳定表达抗端粒酶hTR的M1RNA核酶，为下一步的细胞内实验打下了良好基础。

　　［参考文献］

　　［1］PARKHURST M R, RILEY J P, IGARASHI T, et al. Immunization of patients with the hTERT:540548 peptide induces peptidereactive T lymphocytes that do not recognize tumors endogenously expressing telomerase［J］. Clin Cancer Res, 2004,10(14):4688.

　　［2］OH B K, LEE C H, PARK C, et al. Telomerase regulation and progressive telomere shortening of rat hepatic stemlike epithelial cells during in vitro aging［J］ . Exp Cell Res, 2004 ,298(2):445.

　　［3］VAN MARCK E. Pathology of malignant mesothelioma［J］. Lung Cancer, 2004,45:S35.

　　［4］LI S, ROSENBERG J E, DONJACOUR A A, et al. Rapid inhibition of cancer cell growth induced by lentiviral delivery and expression of mutanttemplate telomerase RNA and antitelomerase shortinterfering RNA［J］. Cancer Res,2004,64(14):4833.

　　［5］TRANG P, LEE J, KILANI A F, et al. Effective inhibition of herpes simplex virus 1 gene expression and growth by engineered RNase P ribozyme［J］. Nucleic Acids Res, 2001, 29: 5071.

　　［6］TRANG P, LIU F, KIM J, et al. Effective inhibition of human cytomegalovirus gene expression and replication by a ribozyme derived from the catalytic RNA subunit of RNase P from Escherichia coli［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2000,97:5812.

　　［7］KRAUS G, GEFFIN R, SSRUILL G, et al. Crossclade inhibition of HIV1 replication and cytopathology by using RNase Passociated external guide sequences［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2002,99: 3406.

　　［8］TRANG P, KILANI A, LEE J, et al. RNase P ribozymes for the studies and treatment of human cytomegalovirus infections［J］. J Clin Virol,2002,25:S63.

　　［9］NADAL A, MARTELL M, LYTLE J R, et al. Specific cleavage of hepatitis C virus RNA genome by human RNase P［J］. J Biol Chem,2002,277(34):30606.

　　［10］COBALEDA C, SNCHEZGARCA I. In vivo inhibition by a sitespecific catalytic RNA subunit of RNase P designed against the BCRABL oncogenic products: a novel approach for cancer treatment［J］. Blood, 2000,95: 731.

　　（本文编辑  厉建强）

　　（青岛大学医学院附属医院，山东 青岛  266003  急诊普外科； 消化内科）