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［摘要］ 目的 探讨更具有优越性的腰椎间盘细胞培养方法。方法 16例胎儿及成人腰椎间盘细胞分别进行单层培养和立体培养，检测细胞分裂指数，进行对比分析。结果立体培养细胞指数生长期分裂指数较单层培养细胞明显增高（t=5.49～9.61，P <0.05），细胞稳定生长期两者分裂指数无明显差异（P>0.05）。结论 立体培养的细胞较单层培养者具有更大的生物学活性。
［关键词］椎间盘;细胞培养技术;细胞分裂
COMPARISON OF CELL DIVISION INDEX OF LUMBAR INTERVERTEBRAL DISC CELLS DETECTED BY DIFFERENT CUL-TURE METHODS
LIU YONG， HU YOU-GU， NING BIN
（Department of Orthopedics， The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College， Qingdao 266003，China）
［ABSTRACT］ Objective To study a much better way to culture lumbar intervertebral disc cells. Methods The lumbar intervertebral disc cells of 16 fetuses and adults were cultured by monolayer and three-dimension methods respectively. The cell di- vision indexes were detected and compared. Results The cell division indexes of the three-dimension group were significantly higher than those of the monolayer group during the exponential growth phase （t=5.49-9.61， P <0.05），but not during the sta-ble growth phase （ P >0.05）. Conclusion Three-dimension cultured cells show more biological activity than those by monolayer culture.
［KEY WORDS］intervertebral disc;cell culture technique; cell division
腰椎间盘退变是引起腰背痛的主要原因之一。 近年来国内外许多学者从细胞生物学水平探讨椎间盘退变的机制，并试图寻找减缓或逆转椎间盘退变的方法。本实验对胎儿及成人腰椎间盘细胞进行单层培养和立体培养，并检测细胞分裂指数，旨在为椎间盘细胞生物学的进一步研究奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料
A组4例，取自保胎失败的足月胎儿的腰椎间盘组织。B（26～35岁）、C（36～45岁）、D（46～75岁）组各4例，均取材于腰椎间盘突出病人术中切除的椎间盘组织。均分为单层和立体培养两种方式进行培养。
1.2 方法
1.2.1 椎间盘细胞单层培养把椎间盘组织剪成1 mm3 大小的碎块。于37 ℃下，以2.5 g/L的胰蛋白酶消化20 min。低速离心（1 000 r/min）5 min。 于36.5 ℃下用2.5 g/L的胶原酶静置消化4 h。用HAMF-12+体积分数为0.10的FBS培养液冲洗，离心（1 000 r/min）5 min，重复3次。细胞分别接种于培养瓶中，加入足含青、链霉素HAMF-12/DMEM+体积分数为0.10的FBS培养液。置于37 ℃ 体积分数为0.05的CO2培养箱中培养。
1.2.2 椎间盘细胞旋转立体培养
称取2.04 g（100 mL）的微载体颗粒，将微载体同旋转培养瓶一同进行环氧乙烷消毒。将微载体放入旋转培养瓶，加入足含青霉素、链霉素的HAMF-12/DMEM+体积分数为0.10的FBS培养液100 mL，将旋转培养瓶置于慢速磁力搅拌器上，以10 r/min的速度旋转。将其置于37 ℃体积分数为0.05的CO2培养箱中24 h 。将单层培养的对数生长期的细胞（密度为105/L）接种于旋转培养瓶中。旋转培养48 h后，将慢速磁力搅拌器的搅拌速度调整至30 r/min。约 5 d半量换液。
1.2.3 细胞分裂指数检测
免疫组化方法检测增殖细胞核抗原（PCNA）。将培养的细胞进行细胞涂片。40 g/L多聚甲醛固定10 min。H2O2室温浸泡30 min。PBS冲洗3次，每次3～5 min。滴加50 g/ L BSA封闭液，室温20 min。滴加小鼠抗PCNA抗体，37 ℃ 1～2 h。滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，37 ℃ 20 min。滴加SABC试剂，37 ℃ 20 min。使用DAB显色试剂室温下显色10 min。苏木精轻度复染。脱水，透明，封片。20倍光镜下随机取5个视野，对阳性细胞进行计数，每组取其均值。
2 结 果
在指数生长期，各组立体培养细胞分裂指数较单层培养细胞均明显增高（ t=5.49～9.61，P <0.05 ）;在稳定生长期，两种培养方法培养的细胞分 裂指数无明显差异（P>0.05）。见表1。表1 椎间盘细胞单层培养和立体培养不同生长时期细胞分裂指数比较（略）
3 讨 论
1991年ICHIMURA等［1］进行了椎间盘细胞的单层培养，观察了对细胞培养的影响因素，检测了蛋白多糖、胶原和DNA的合成。1999年刘勇等［2］成功进行了胎儿椎间盘细胞的单层培养，对椎间盘细胞的形态进行了观察;2005年刘勇等［3］对人退变 细胞进行培养并对细胞凋亡进行了研究。目前，国内、外进行椎间盘细胞单层培养的实验研究较多，技术方法已经成熟。随着椎间盘细胞生物学研究的不断深入，越来越多的学者对椎间盘细胞三维培养进行了探讨。GRUBER等［4］从人的椎间盘细胞形态、分裂和细胞外基质形成等方面研究了单层培养和三维培养的异同，发现在血小板源性生长因子存在的情况下，三维培养的细胞的增殖能力明显高于单层培养的细胞。BOTCHWEY等［5］在生物反应器中对成骨性细胞进行了培养，与静止细胞培养比较发现，前者可以保持成骨性细胞显型，并且可增加细胞碱性磷酸 酶表达和基质矿化，显示立体培养较单层培养具有优越性。本实验中椎间盘细胞立体培养采用微载体旋转培养系统，属于动力性三维培养，研究表明，指数生长期立体培养的细胞较单层培养的细胞分裂指数明显增高，提示立体培养的细胞具有更大的生物学活性，此旋转培养系统能够促进氧气和营养物质向载体内部输送，保持载体内部细胞的活性和功能的发挥;微载体颗粒的表面能够促进黏附生长的椎间盘细胞的增殖，促进椎间盘细胞再生，为细胞代谢和功能发挥提供更有利的微环境。
［参考文献］
［1］ICHIMURA K， TSUJI H， MATSUI H， et al. Cell culture of the intervertebral disc of rats: factors influencing culture， pro-teoglycan， collagen， and deoxyribonucleic acid synthesis［J］. J Spinal Disord， 1991，4（4）:428-436.
［2］刘勇，胡有谷，吕振华. 腰椎间盘细胞的培养及形态学观察 ［J］. 中华医学杂志，1999，75:109-111.
［3］刘勇，胡有谷，宁斌. 人退变椎间盘细胞培养及细胞凋亡的研 究 ［J］. 青岛大学医学院学报，2005， 41（3）:218-219.
［4］GRUBER H， HANLEY E. Human disc cells in monolayer vs 3D culture: cell shape， division and matrix formation ［J］. BMC Musculoskelet Disord， 2000，1（1）:1.
［5］BOTCHWEY E， POLLACK S， LEVINE E，et al. Bone tis- sue engineering in arotating lioreactor using a microcarried ma- trix system［J］. J Biomed Mater Res， 2001，55:242-253.
（青岛大学医学院附属医院骨科，山东 青岛 266003）