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［摘要］目的 探讨乌鸡白凤丸有效成分（BFP）对1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）诱致C57BL小鼠黑质神经元凋亡的保护作用及其可能机制。方法 C57BL小鼠连续5 d皮下注射MPTP（30 mg/kg）制备帕金森病小鼠模型。给予BFP预处理后，用酪氨酸羟化酶（TH）免疫组织化学法观察黑质神经元的变化;同时应用免疫组织化学法检测Bax蛋白表达;应用高效液相-电化学方法检测纹状体（Str）多巴胺（DA）及其代谢产物二羟基苯乙酸（DOPAC）和高香草酸（HVA）的含量变化。结果 BFP预处理能使黑质致密带（SNc）TH免疫阳性神经元数目较MPTP组明显增多，而Bax蛋白表达较MPTP组明显减少;可使Str区DA及其代谢产物DOPAC、HVA含量明显增加。结论 BFP有效成分可以拮抗神经毒性物质MPTP对C57BL小鼠黑质多巴胺能神经元的损伤，其作用机制可能与其抗凋亡作用有关，Bax表达的降低可能是BFP抗凋亡作用的途径之一。
［关键词］ 帕金森障碍;乌鸡白凤丸;细胞凋亡;多巴胺;黑质
NEUROPROTECTIVE EFFECT OF Bak Foong Pill EXTRACTS ON MPTP-INDUCED PARKINSON'S DISEASE MOUSE MODEL
JIE GUI-XIANG， JIANG HONG， WANG JUN， et al
（Department of Physiology， Qingdao University Medical College， Qingdao 266021， China）
［ABSTRACT］ObjectiveTo explore the neuroprotective effect of Bak Foong Pill （BFP） extract on the apoptosis of substan-tia nigra neurons induced by 1-methyl-4-phenyl-1， 2， 3， 6-tetrahydropyridine （MPTP） in C57BL mice and its possible mechanism. MethodsIn the control group， C57BL mice received MPTP （30 mg/kg） subcutaneous injection for five days to establish the PD model. In the pretreatment group， Bak Foong Pill extracts were given for 14 days prior to MPTP. Immunostaining of tyrosine hydroxythase （TH） was used to observe the damage of dopamine （DA） neurons， and of Bax to detect the protein levels of Bax. High performance liquid chromatography-electrochemical detection （HPLC-ECD） was used to investigate the contents of DA and its metabolites dihydroxy-phenylacetic acid （DOPAC） and homovanillic （HVA） in the Str. ResultsCompared with the control group， neurons in the substantia nigra zona compacta of the pretreatment group markedly increased the immunoexpression of TH and reduced the expression of Bax. Contents of DA and its metabolites DOPAC，HVA were also increased. ConclusionBFP ex-tracts showed protective effect on dopaminergic neurons against MPTP-induced neurotoxicity in the PD model mice. The neuropro-tective effect might be attributed to anti-apoptosis manifested by decreased expression of Bax.
［KEY WORDS］ Parkinsonian disorders; Bak Foong Pills; apoptosis; dopamine; substantia nigra
帕金森病（PD）是一种中枢神经系统退行性疾病，也是老年人多发病，55岁以上人群发病率约1%。PD最主要病理特征是中脑黑质致密带（SNc）DA能神经元进行性变性、脱失及伴发的纹状体轴突末梢DA耗竭，从而导致基底节神经调节功能的紊乱。PD的典型症状为静止震颤、肌肉僵硬、运动迟缓及姿势反射异常。目前由于PD的发病机制仍 不清楚，遗传、环境、自由基、兴奋性氨基酸毒性作用、线粒体功能障碍等多种因素可能与PD的发生有关，而细胞凋亡可能是导致PD病人DA能神经元死亡的重要原因之一［1］。因此，抗细胞凋亡可能会起到保护DA能神经元的作用。目前对于PD的治疗方案多是对症治疗，30多年来左旋多巴一直是做为首选药物［2］，然而左旋多巴的长期应用也有明显的副作用［3］，因此预防DA能神经元变性从而延缓PD的发生可能会成为一种替代治疗手段。乌鸡白凤丸有效成分（BFP）是一种广泛用于治疗妇科疾病的传统中药，并具有雌激素样作用活性，如降低血压、增加血管舒张度、减少血 清三酰甘油、抗血小板活性［4］以及刺激脑内 DA 释 放等多种药理作用，但目前其药理方面的实验研究鲜有报道。本研究以C57BL小鼠为研究对象，用MPTP制备PD小鼠动物模型，观察BFP预处理对MPTP导致的黑质DA能神经元凋亡是否具有保护作用，并对其机制进行了初步探讨。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器 C57BL小鼠由北京维通利华动物中心提供;BFP由香港中文大学生理系陈小章教授馈赠;酪氨酸羟化酶（TH）抗体、1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）购自美国Sigma公司;TH免疫组化试剂盒、Bax抗血清、SABC试剂盒及DAB试剂盒由北京中山生物技术公司提供;高效液相色谱仪为美国Waters公司产品。
1.2 动物模型建立及分组 10～11周龄C57BL小鼠36只，雌雄各半，体质量（20±2）g，于20～24 ℃室温及相对湿度 50%～ 60%昼夜循环光照条件下生活，自由饮水、取食，实验前适应实验室环境1周。随机分为3组:①MPTP组:每天9:00给予小鼠腹腔注射MPTP（ 30 mg/kg ），连用5 d［5］;②BFP+MPTP组:每天9:00小鼠口服喂食BFP（3 g/kg），每天1次，连用14 d，第15天给予小鼠口服喂食BFP（3 g/kg），同时腹腔注射MPTP（30 mg/kg），每天1次，持续到第19天;③正常对照组:口服喂食等体积生理盐水。于每次注射药物后均观察小鼠行为变化。
1.3 TH免疫组织化学染色
1.3.1取材 用80 g/L水合氯醛将小鼠麻醉后，行主动脉插管，快速灌注150～200 mL生理盐水冲洗血液，随即灌注300 mL含40 g/L多聚甲醛（ 4 ℃ ）的0.1 mol/L磷酸缓冲液（PB），先快后慢。然后断头取脑，置于同一固定液中4 ℃固定6 h，再置入含250 g/L蔗糖的PB液内4 ℃过夜或至脑组织块沉入瓶底。
1.3.2冷冻切片 将脑组织块于冠状黑质平面连续冷冻切片，片厚20 μm。切片间隔分成2套，分别进行TH免疫组织化学染色和Bax免疫组织化学染色。
1.3.3TH染 色 切片置入含体积分数0.003 H2 O2 的甲醛溶液中37 ℃孵育15 min，以消除内源性过氧化物酶活性，0.01 mol/L PBS（pH 7.4）冲洗，共3次，每次5 min;行抗原修复后滴加体积分数0.01的正常山羊血清，37 ℃孵育15 min，吸去山羊血清，加一抗（1∶5 000，用抗体稀释液稀释），于湿盒内4 ℃过夜;PBS冲洗，滴加生物素标记的二抗工作液，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗;滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液，37 ℃孵育 30 min， PBS冲洗，DAB显色10～15 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，最后镜下观察并照相。阳性细胞为细胞浆和突起着棕黄色。
1.4 Bax免疫组织化学染色 参照TH免疫组织化学染色方法，一抗为兔抗小鼠Bax（1∶200，用抗体稀释液稀释）多克隆抗体。阳性细胞为细胞浆着棕黄色。
1.5 阳性细胞计数 取SNc最明显处的3张切片，在密集阳性细胞中央部分取4个互不重叠的高倍视野（400倍），计数视野内阳性细胞数，顺序为自上而下，由左至右，不完全位于视野内的细胞不计数，最后把各视野内的细胞数相加后再取平均数。
1.6 纹状体（Str）内DA及其代谢产物二羟基苯乙酸（DOPAC）、高香草酸（HVA）含量的测定
1.6.1标准溶液的稀释 DA、DOPAC、HVA的标准溶液最后用流动相倍比稀释得6个浓度梯度:每20 μL含16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5 ng。
1.6.2组织样品制备 在实验结束后，取正常对照组、MPTP组及BFP+MPTP组小鼠各6只，麻醉后断头取脑，于冰盒上分离并保留纹状体组织，保存于-70 ℃冰箱备用。
1.6.3组织样品预处理 将组织样品转入1.5 mL EP管中，准确称量，加入冰冷的样品预处理A液100 μL，冰浴中超声振动10 s，冰浴静置1 h后，4 ℃条件下，12 000 r/min离心20 min，取80 μL上清液转入另一支EP管中，加入40 μL冰冷的预处理B液，涡旋混匀，冰浴静置1 h，再于同一条件下离心 20 min ，-70 ℃冷冻保存待测。
1.6.4上 样分析及绘制标准曲线 设定样品流量1.0 mL/min，ECD设定电压0.65 V，每一样品检测35 min。各标准品分别进样，检测其保留时间作为定性指标。将各标准品混合并稀释成6个浓度梯度，分别进样，检测并绘制标准曲线，求得直线回归方程。
1.7 统计学处理 实验结果以 x±s 表示，应用SPSS 10.0统计软件进行数据处理。
2 结果
2.1BFP对MPTP制备的PD小鼠行为及SNc内TH免疫阳性细胞数目的影响 MPTP组小鼠在MPTP注射后数分钟可出现阵发性躯干震颤、竖毛、频繁的窜蹦及爬杆不能等短暂的行为反应，随后出现活动减少，随MPTP注射次数增加上述表现愈加严重，但次日略见恢复。给予BFP+MPTP组上述表现不明显。MPTP组SNc的TH免疫阳性细胞数量为（ 8.03± 0.09），较正常对照组（21.17±0.85）减少，而BFP+MPTP组的TH免疫阳性细胞数量（ 17.29± 1.69）较MPTP组明显增多。对染色结果的统计分析表明，MPTP组TH免疫阳性细胞数量较正常对照组明显降低（ F=228.73，q=29.44，P <0.01）;BFP+MPTP组的TH免疫阳性细胞数量与MPTP组相比明显升高（ q=20.74，P <0.01）。
2.2 BFP对MPTP制备的PD小鼠黑质Bax蛋白表达水平的影响 Bax在胞浆内表达，为棕黄色颗粒状、丝状或条状物质。正常对照组黑质神经元Bax表达较少，细胞浆染色较浅，阳性细胞数目较少，为（14.73± 1.47 ）个;MPTP组黑质神经元胞浆内棕黄色颗粒状、丝状或条状物质较多、较深，染色细胞数目增多，为（32.40±2.67）个;而BFP+MPTP组的染色细胞数目为（18.99±1.23）个。对染色结果的统计分析表明，MPTP组Bax免疫阳性细胞数量与正常对照组比较明显升高（ F=35.56，q=22.31，P < 0.01 ）;而BFP+MPTP组的Bax免疫阳性细胞数量与MPTP组比较显著降低（ q=16.93，P <0.01）。
2.3 BFP对MPTP制备的PD小鼠Str区DA及其代谢产物含量的影响 MPTP组Str内DA及其代谢产物DOPAC和HVA的含量降低，与正常对照组相比差异具有显著性（ F=18.85～128.29，q=8.67～22.46，P < 0.01 ）。BFP+MPTP组Str内DA及其代谢产物DOPAC和HVA的含量比MPTP组升高，两者差别具有统计学意义（ q=4.79～13.81，P <0.01）。见表1。
表1 BFP对MPTP制备PD模型小鼠Str区DA及其代谢产物含量的影响（略）
3 讨论
PD是一种老年人常见的神经系统变性疾病，主要病理改变是SNc DA能神经元进行性变性缺失。在生化方面的改变，一般认为是TH的缺失导致Str内DA及其代谢产物含量的减低，从而引起一系列的症状。MPTP可引起SN-Str DA能神经元的变性，线粒体能量耗竭和氧化应激反应，是一种可用于诱导制备PD模型的神经毒性物质，可导致灵长类和小鼠SN-Str通路的DA能神经元变性，因此可模拟出PD的临床和病理特征，用MPTP制备的小鼠模型是国内外公认的最好的PD动物模型之一，已被广泛用于该病发病机制和治疗等研究。本研究给予C57BL小鼠皮下注射嗜神经毒素MPTP（30 mg/kg）连续5 d制成PD小鼠模型，采用HPLC法检测其Str内DA及其代谢产物DOPAC和HVA的含量，发现MPTP组Str内DA及HVA含量明显下降，运用免疫组织化学染色法可观察到MPTP组SNc TH免疫阳性神经元数目与正常对照组相比明显减少，故可以判定此MPTP致小鼠PD模型造模成功。实验结果同时显示，经BFP预处理后，SNc DA能神经元脱失现象减少，凋亡细胞比例也明显减少，提示BFP有抗MPTP诱致黑质神经元凋亡的作用。Bax基因作为Bcl-2家族中调控细胞凋亡进程的代表基因之一，是近年来研究的热点。有研究显示，黑质内几乎所有的神经元，尤其是DA能神经元内含有大量的Bax蛋白，并在生长发育过程中调控着DA能神经元凋亡的进程。ZIV等［6］用PC12细胞系研究发现，Bcl-2能明显抑制DA氧化及其氧化产物的生成，并且能阻止细胞内还原型谷胱甘肽（GSH）水平下降。另有研究显示，Bcl-2过度表达的转基因小鼠可抵抗MPTP和6-0HDA对黑质DA能神经元的损害。此外，Bcl-2还可以通过其他途径，如影响细胞内Ca2+内流、阻止线粒体中细胞色素C的释放等发挥抗凋亡作用，而Bax蛋白则是通过与Bcl-2相关蛋白形成二聚体的形式来发挥作用，故能诱导细胞凋亡。HASSOUNA等［7］发现小鼠注射MPTP后，其脑内黑质区Bax mRNA合成增加，呈现相应Bax免疫反应性的神经元都发生了死亡，说明MPTP毒性作用诱导Bax表达，其病理学意义是促进凋亡的发生。本文研究显示，MPTP可诱导黑质Bax蛋白表达水平增加，与以前研究结果相符［8］; 同时，BFP+MPTP组的黑质Bax蛋白表达降低，提示BFP阻断MPTP诱导的黑质神经元凋亡的可能的途径之一是通过减少Bax表达来发挥其抗细胞凋亡作用的，从而证实了BFP有效成分的作用机制与抗凋亡有关。由于PD的发病是多种致病因素如遗传、环境、年龄等共同作用的结果，其病因和发病机制尚未完全清楚。目前，PD的治疗主要是DA的替代疗法，即服用左旋多巴来弥补脑内DA不足，以改善临床症状，但这并不能阻止DA能神经元的继续凋亡，而且DA本身也可诱导神经元的凋亡［3］，左旋多巴的这些副作用极大地限制了它的应用。近几年来，随着对PD发病机制研究的快速发展以及对细胞凋亡研究的深入，在对PD病人的实验研究中发现了黑质神经元的凋亡，从而进一步支持细胞凋亡与PD发病机制的相关性。而目前尚无一种理想的药物和治疗方法能有效地减缓、阻止甚至逆转PD病人中脑黑质神经元的变性过程，因此，寻找一种确实有效的抗PD的药物具有重要的临床意义。本文研究结果表明，MPTP诱导黑质神经元凋亡与增加促凋亡蛋白Bax表达有关，而BFP的保护作用途径之一就是通过逆转神经元中凋亡调控蛋白的异常表达来实现的，BFP对DA能神经元的神经保护作用及其可长期应用性将有望成为临床防治PD的辅助治疗手段之一。
［参考文献］
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［7］ HASSOUNA I， WOCKERT H. Increase in bax expression in substantia nigra following 1-methy-4-pheny-1，2，3，6-tetrahy-dropyridine（MPTP） treatment of mice［J］. Neurosci Lett， 1996，204（1-2）:85-90.
［8］ LIU B， XIE J X. Neuroprotective effects of Bak Foong Pill in 1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahyrdropyridine （MPTP）-in-duced Parkinson's disease model mice［J］. Biol Pharm Bull， 2004，27（8）:1245-1250.
（本文编辑 厉建强）
［基金项目］山东省科技厅资助项目（031070125）和青岛市科技局项目资助（04-2-JS-136，05-10-JC-97）
（青岛大学医学院生理学教研室，山东 青岛 266021）