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［摘要］目的 探讨封闭抗体免疫疗法对免疫性不孕症与习惯性流产病人治疗的效果。方法 对138例不孕症及习惯性流产病人行封闭抗体免疫治疗2个疗程。采用单向混合淋巴反应封闭试验、单向混合淋巴细胞反应封闭抑制试验、细胞毒试验及封闭抗体流式细胞分析术检测治疗前后病人混合淋巴细胞反应封闭效率（MLR-BE）、抗独特型抗体、细胞毒指数（CI）及抗CD抗原的封闭效率（抗CD-BE）。结果 治疗后不孕症及习惯性流产病人的MLR-BE、抗独特型抗体、CI和抗CD-BE均有不同程度的上升，与治疗前相比，差异均有显著性（ t=2.32～38.66，P <0.05、0.01）。治疗2疗程后与治疗1疗程后相比，差异亦有显著性（ t=2.15～12.46，P <0.05、0.01）。结论封闭抗体免疫疗法治疗免疫性不孕症 及习惯性流产具有重要的临床意义和应用价值。
［关键词］ 不孕症，免疫;流产，习惯性;抗体，封闭;疗法，免疫
THE EFFICACY OF IMMUNOSUPPRESSIVE THERAPY USING BLOCKING ANTIBODIES FOR IMMUNE INFERTILITY AND HABITUAL ABORTION
SUN LING
（Central Laboratory， Qingdao Municipal Hospital， Qingdao 266011， China）
［ABSTRACT］ObjectiveTo evaluate the clinical effects of immunosuppressive treatment using blocking antibodies on im-mune infertility and habitual abortion. MethodsThis study was conducted in 138 patients who were given blocking antibodies for two courses. One-way mixed lymphocyte reaction blocking test and complement-dependent cytotoxic test， anti-idiotypic anti-bodies to blocking antibodies by one-way mixed lymphocyte reaction blocking inhibiting test were used to monitor blocking antibo- dies ， and flow cytometry evaluation of blocking antibodies was used to investigate effect of blocking antibodies on the CD antigens of T cells. T-Test was used for statistical analysis. ResultsAfter one course of treatment， the levels of MLR-BE， their anti-id-iotypic antibodies， CI， anti-CD3-BE， anti-CD4-BE， anti-CD8-BE， and anti-CD4-BE/anti-CD8-BE of immune infertility greatly in-creased compared with those of before treatment （ t=2.32-38.66;P<0.05， 0.01）. After two courses， the MLR-BE， the anti- idiotypic antibodies， CI， anti-CD3-BE， anti-CD4-BE， anti-CD8-BE， and anti-CD4-BE/anti-CD8-BE of immune infertility greatly in-creased compared with those of before treatment， and the difference was significant compared with those after one course of treat-ment （ t=2.15-12.46; P<0.05， 0.01）. ConclusionThe immunosuppressive therapy using blocking antibodies is of great clinical significance and value for infertility and habitual abortion.
［KEY WORDS］infertility， immune; abortion， habitual; antibodies， blocking; therapy， immunosuppressive
临床上许多原因不明确的不孕症以及习惯性流产的病人，经检查抗子宫内膜抗体、抗卵巢抗体和抗精子抗体全部或部分阳性，提示其发病可能由免疫机制以及母胎免疫调节异常造成。2001年6月～2004年6月，我院中心实验室采用封闭抗体疗法对138例免疫性不孕症及习惯性流产病人进行治疗，现将结果报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 本组138例病人，为我院生殖健康门诊和妇产科接诊病人，年龄22～37岁，平均29.5岁。其中免疫性不孕症46例，习惯性流产92例。所有病例均经临床检查确诊。
1.2 治疗方法取病人配偶肘静脉血，抗凝，常规分离、浓缩提取淋巴细胞，用9 g/L NaCl溶液洗涤干净后稀释至活细胞>3×107 /L。在病人前臂三角肌处皮下、皮内各注射3点，共1 mL。每3周1次，4次为1个疗程。治疗2个疗程。上述操作严格无菌。
1.3 检测指标及方法
1.3.1混合淋巴细胞反应封闭效率（MLR-BE） 以单向混合淋巴细胞 反应封闭试验检测MLR-BE，方法参见文献［1］，并对其进行改进:以丝裂霉素处理的配偶外周血淋巴细胞作为刺激细胞（1×109 /L，0.1 mL）;以病人外周血淋巴细胞作为反应细胞（1×109 /L，0.1 mL），将刺激细胞与等量病人血清于37 ℃水浴1 h后，去上清。以未经病人血清处理的刺激细胞为对照，在含有体积分数0.25的AB型血清中，与反应细胞于含体积分数0.05 CO2 、37 ℃条件下孵育5 d后，每孔加3 H-TdR 2.22×1010μBq，继续培养18 h后收样， 分别测定各孔放射性核素每 分钟闪烁计数（min -1）值。按下列公式计算MLR-BE。MLR-BE=（1-A/B）×100%。其中A为刺激细胞与病人血清作用后，加反应细胞在体积分数0.25 AB型血清中培养的每分钟闪烁计数值，B为刺激细胞加反应细胞在体积分数 0.25 AB型 血清中培养的每分钟闪烁计数值。
1.3.2抗独特型抗体 以单向混合淋巴细胞反应封闭抑制试验，检测抗封闭抗体的独特型抗体。在MLR-BE实验方法基础上，在含体积分数0.25病人血清中混合淋巴细胞培养，以分析病人血清中可能存在的抗封闭抗体的独特型抗体对MLR-BE的作用。按下列公式计算抗独特型抗体。抗独特型抗体=（C-A）/B×100%。其中C为刺激细胞与反应细胞在病人血清中培养的每分钟闪烁计数值。
1.3.3细胞毒指数（CI） 参见文献［1］方法，取微量细胞毒试验板，分别设加补体、不加待检血清及加待检血清、不加补体的阴性对照组，加抗人淋巴细胞血清（ALS）并加补体的阳性对照组;以配偶外周血 淋巴细胞作为指示细胞，按标准细胞毒试验法检测病人血清中作用于配偶淋巴细胞膜表面抗原的细胞毒抗体。按下列公式计算CI。CI=（样品平均死细胞率-阴性对照组平均死细胞率）/（100%-阴性对照组平均死细胞率）×100%。
1.3.4抗CD抗原的封闭效率（抗CD-BE） 采用流式细胞分析技术。参见文献［2］方法，以配偶外周血淋巴细胞为抗原靶标，以正常人AB型血清为对照，分析病人血清中封闭抗体分别对CD3、CD4及CD8抗原的作用。按下列公式计算抗CD-BE。抗CD-BE（%）=加AB型血清CD比例-加病人血清CD比例。
2 结果
治疗后不孕症及习惯性流产病人的MLR-BE、抗独特型抗体、CI和抗CD-BE均有不同程度上升，与治疗前相比，差异均有显著性。治疗2疗程后与治疗1疗程后相比，差异亦有显著性。见表1、2。
表1 不孕症病人治疗前后各检测指标的动态变化（略）
与治疗前比较，*t=5.66～38.66，P <0.01;与治疗1疗程比较，#t=2.15～11.75，P<0.05、0.01
表2 习惯性流产病人治疗前后各检测指标的动态变化（略）
与治疗前比较，*t=2.32～34.41，P <0.05、0.01;与治疗1疗程比较，#t=4.86～12.46，P <0.01
3 讨论
原因不明的不孕以及习惯性流产病人临床常见。妊娠是一个复杂的生理过程，从免疫学上来看类似于器官移植。带有父方异体抗原成分的胚胎，对母体来说是一个移植物，在母胎界面上，母体与胚胎细胞之间存在相互识别。母体识别胚胎的抗原，并产生封闭抗体。一方面，封闭抗体与母体的细胞毒性淋巴细胞结合，封闭其细胞毒作用，阻止其对胎儿的杀伤;另一方面，封闭抗体与胚胎细胞上的抗原结合，从而阻断了母体的淋巴细胞到胚胎细胞的通路。现代免疫学认为，在器官移植中，供受双方的HLA相容性越大，移植成功率越高。而在母胎界面 上，母胎HLA相容性越大，那么，母体就不能识别胚胎抗原，就不能产生封闭抗体，胚胎得不到封闭抗体的保护就会遭排斥，即产生病理性妊娠，如流产、不孕、妊娠高血压综合征、早产等。HLA与包括原因不明的不孕及习惯性流产在内的病理性妊娠密切相关联［3］。习惯性流产是指排除生殖器官疾病、内分泌失调、受精卵染色体异常、环境因素所致的连续3次以上的原因不明性流产。KOMLOS等［4］最早发现，流产组夫妇共有HLA-A、HLA-B抗原比例高于正常对照组。另有研究显示，原发性习惯性流产与HLA-DR、HLA-DQ均有相关性，继发性习惯性流产与HLA-DR、HLA-DQ无相关性［5～7］。随着辅助生育技术的应用，对HLA抗原与原因不明的不孕症间关系的研究也进一步深入［8］。WECKSTEIN等［9］对经体外受精-胚胎移植治疗后而未妊娠的10例病人研究结果显示，7例与其丈夫HLA位点共享数达3个以上，而10例正常对照者中，只有4例与其丈夫共享位点达3个或以上。BALASCH等［10］报道，44.4%经辅助生育技术治疗失败者及21.5%的成功者与其丈夫共享3个以上的HLA抗原。因此，提取配偶淋巴细胞，通过主动免疫刺激病人主动产生有利于胎儿胎盘单位存活的封闭抗体，以提高病人体内封闭抗体水平，是治疗原因不明的不孕及习惯性流产的有效措施。依据主动免疫原理，利用配偶淋巴细胞刺激机体产生封闭抗体来抑制混合淋巴细胞反应，可抑制致敏T淋巴细胞的杀伤功能。本文对138例病人实施封闭抗体免疫治疗后，各项封闭抗体指标均较治疗前明显升高，提示封闭抗体免疫疗法治疗不孕症及习惯性流产具有重要的临床意义和应用价值。临床上除认真采集病人病史和家族史外，可以考虑将MLR-BE、抗封闭抗体的独特型抗体、CI和抗CD-BE作为优生咨询的常规项目，以判断是否实施封闭抗体免疫疗法作为预防性治疗，以减少病理性妊娠的发生。该疗法实施前对病人及其配偶的血液应做血型、乙型肝炎病毒表面抗原等的检验，以防止血型不合以及传染病的传播。每次治疗的效果理论上取决于注射入机体的淋巴细胞数目，因此处理过程中应分离提取尽可能多的淋巴细胞并充分洗涤。全程严格无菌操作至关重要。另外，对经治疗已经妊娠的病人应进行巩固治疗。
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［8］ 王 涛，孟凡会. 不孕症病人卵泡发育和子宫内膜的超声监测［J］.齐鲁医学杂志，2001，16（2）:82-84.
［9］ WECKSTEIN L N， PATRIZIO P， BALMACEDA J P， et al. Human leukocyte antigen compatibility and failure to achieve a viable pregnancy with assisted reproductive technology［J］. Acta Eur Fertil， 1991，22:103-107.
［10］ BALASCH J， INMACULADA J， MARTOREL J， et al. His-tocompatibility in vitro fertilization couples［J］. Fertil Steril， 1993，59:456-458.
（本文编辑 黄建乡）
（青岛市市立医院中心实验室，山东 青岛 266011）