树突状细胞在儿科疾病中的临床应用研究进展

     树突状细胞（DC）是目前所知的人体内功能最强的，也是唯一可以激活初始T细胞的专职性抗原提呈细胞［1］,是机体免疫应答的始动者，其在抗感染免疫、移植免疫、肿瘤免疫、免疫激活及免疫耐受中扮演着重要的角色。DC广泛分布于除脑以外的全身其他脏器，但数量极少，缺乏相对特征性的抗原标志，难以纯化。多年来人们一直在探索获取DC的有效方法，包括最初的从含有DC的组织（如皮肤、扁桃体及外周血等）中通过密度梯度离心获取DC，以及目前从脐血、骨髓、动员的外周血的单核细胞或CD34+造血干细胞［1］（HPC）,甚至从血液系统肿瘤细胞［2］培养获得DC。如何在短时间内获得足够数量的DC是深入研究DC生物学特性、功能和临床应用的前提和关键。由于脐血相对容易获得，CD34+细胞对各种造血因子反应能力、增殖与分化能力、体外集落形成能力、刺激后进入细胞周期的速度及自分泌生长因子的能力较强。且CD34+细胞端粒较长，端粒酶活性较高，低表达甚或不表达细胞凋亡配基CD95/Fas，生命力强，脐血移植时HLA配型要求相对不太严格。且在相同条件下，脐血CD34+细胞来源的DC与骨髓CD34+细胞来源的DC具有相同的功能［3］，这些因素提示人脐血CD34+细胞可能是一个可以大量获取DC的理想来源。现将近年有关研究综述如下。

    1  DC的获取方法及其比较

    1.1  从脐血中直接分离DC（CBDC）脐血通过免疫磁珠法的阴性选择获得CBDC，与外周血DC（PBDC）一样，也包括淋巴系DC和髓系DC。CBDC与PBDC表型相似，脐血中的淋巴系DC与髓系DC相比，其MHCⅡ分子、协同刺激分子的表达水平较低，混合淋巴细胞反应（MLR）中不能有效地刺激同种异型T细胞（alloT）增殖，这说明了脐血中淋巴系DC是不成熟的。脐血的淋巴系DC与髓系DC之比约为3∶1,而外周血中二者之比约为1∶3。CBDC占脐血单个核细胞的（0.16±0.12）%，而PBDC占外周血单个核细胞的0.1%～1.0%［4］。

    1.2  脐血单核细胞诱导DC（CBMODC）脐血单个核细胞经贴附塑料平皿或经免疫磁珠法分选，获得脐血单核细胞，后者经粒巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF）、白细胞介素4（IL4）诱导分化为DC。

    1.3  外周血单核细胞诱导DC（PBMODC）用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，贴壁法获得单核细胞，经GMCSF、IL4诱导获得DC。

    1.4  脐血CD34+细胞诱导DC

    1.4.1  传统的从脐血CD34+细胞诱导DC方法  多采用在GMCSF、肿瘤坏死因子α（TNFα）支持的基础上，加用具有协同扩增效应的早期细胞因子干细胞因子（SCF）、酪氨酸激酶受体家族Ⅲ配体（FL）、血小板生成素（TPO）等，以提高DC的产量。其中SCF和FL可以促进早期多能干细胞进入细胞循环，有利于生成DC与单核细胞的共同集落形成单位（CFUDL）。同时，SCF和FL还可以显著地提高DC刺激alloT增殖能力。TPO尽管也可明显提高细胞总产量，但DC的比例下降，使DC绝对数无明显变化［5］。GMCSF的主要作用是使细胞向DC和巨噬细胞分化。在前期加入GMCSF可能会使干细胞向巨噬细胞方向分化，以致总细胞中DC的前体细胞下降，在后期无法诱导出DC。IL4和TNFα的作用是抑制巨噬细胞的生成，使更多的细胞分化成为DC。CD34+细胞在GMCSF和TNFα诱导下可沿两条不同的途径分化，一条是先分化为CD1a+的前体DC，然后再分化为朗格汉斯细胞（LC）；另一条是先分化为CD14+的前体DC，再分化为表达CD1a、CD2、CD9、CD68及因子Ⅷ的DC［6］。

    1.4.2  两步法从脐血CD34+细胞扩增诱导DC  第一步先用不同的细胞因子组合（SCF/FL/TPO、SCF/IL3/IL6、SCF/FL/TPO/GNCSF、SCF/FL/TPO/IL3/IL6）扩增脐血CD34+细胞，然后在第二步中用GMCSF和IL4将扩增后的细胞诱导成为DC，这不仅不会影响DC的表型及生物学功能，而且所得到的DC的产量明显提高［7］。在其他培养条件相同的情况下，综合总细胞扩增倍数及诱导所得的CD1a+细胞纯度的情况，用SCF/FL/TPO/IL3/IL6来扩增脐血CD34+细胞能获得最多的DC。另外，直接诱导所得的CD1a+细胞纯度比两步法高，但综合总细胞扩增倍数及诱导所得的CD1a+细胞纯度的情况，两步法扩增诱导的DC大大超过直接法诱导所获得的DC。脐血CD34+细胞扩增时间对DC纯度的影响不大，但随着时间的延长，总细胞数却有显著增加，因而DC的扩增倍数随着CD34+细胞扩增时间的增加不断增加。两步法从脐血CD34+细胞扩增诱导的DC数量比直接诱导获得的细胞数量要大得多。

    2  DC的生物学特性

　DC为一群异质性的细胞，它们在解剖定居部位、细胞表型和功能方面有所不同，但是，它们具有一些共同的特点：①均起源于骨髓CD34+细胞， DC前体细胞通过血流进入外周组织，生成不成熟的DC，包括LC和间质DC；②不成熟的DC通过受体介导和非受体介导的机制摄取抗原，以细胞内小泡形式降解抗原，形成抗原肽，与MHCⅡ类分子结合形成抗原肽MHCⅡ类分子复合物。不成熟DC上有较多的趋化因子受体（CCR），对趋化因子做出反应，迁移到炎症部位；③遇到危险信号如组织损伤、病原体来源的产物及炎症细胞因子后，DC发育成熟并迁移到淋巴器官，在那里与抗原特异性CD4 T细胞相互作用，启动免疫反应；④成熟的DC具有较强的抗原提呈能力，通过第一信号、第二信号和第三信号刺激T细胞增殖分化。其中第一信号来自DC表面的抗原肽：MHC分子复合物与T细胞受体（TCR）的结合;第二信号来自DC上的协同刺激分子与T细胞表面的相应受体的结合；第三信号来自DC分泌IL12促进Th0细胞向Th1细胞方向分化或DC不分泌IL12介导Th0细胞向Th2细胞方向分化［8］。成熟DC除具有典型树突状突起外，胞浆中含有大量参与抗原提呈的细胞结构，如MⅡC、高尔基体等。人DC的主要特征性标志为CD1a、CD11c及CD83，DC还高水平表达MHCⅠ、Ⅱ类分子，协同刺激分子（CD80、CD86、CD40），黏附分子（CD44、CD54），β1、β2整合素家族成员及CCR等。DC可以通过诱导Ig类别转换、释放某些可溶性因子等直接调节B细胞的增殖与分化。DC还能诱导免疫耐受，是目前发现的在胸腺内对发育过程中T细胞进行阴性选择的最重要的细胞，通过排除自身应答性克隆，参与中枢免疫耐受的诱导。血循环中的抗原可以到达胸腺，由胸腺DC提呈，外周血DC也可能携带外周抗原进入胸腺，并由胸腺DC实现对某些外来抗原的体内致耐受作用。DC亦可在外周参与外周免疫耐受的诱导。

    3  DC在儿科疾病中的临床应用研究

    3.1  DC与病毒感染病毒具有特殊的生物学特性，只能在活细胞内以复制的方式进行繁殖，而且某些病毒（HBV、HCV、HIV）感染靶细胞之后会引起慢性感染，因此抗病毒免疫的效应物质必须直接作用于病毒感染的靶细胞，以中断胞内病毒大分子物质的合成。这种作用主要依赖于细胞免疫，DC是目前发现的唯一能激活初始型T细胞的抗原提呈细胞，在细胞免疫中发挥重要作用。通过体外病毒抗原冲击的方式致敏DC，再回输体内，使之激活T细胞，产生特异性细胞毒性淋巴细胞（CTL），从而杀伤病毒感染的细胞。病毒致敏DC的方法有多种:①病毒抗原多肽或蛋白直接冲击DC ,②灭活或减毒的病毒疫苗与DC共同孵育，③阳离子脂质体携带病毒蛋白冲击DC，其中第一种方法最为常用。MADHAV等［9］以外周血来源的DC为研究对象，分别用破伤风毒素和流感病毒基质肽冲击致敏DC，再将致敏的DC注射于受试者的皮下，发现1次注射后多数受试者在1周内产生特异性CTL细胞。同时，AKBAR等［10］的研究显示，采用乙肝疫苗治疗HBV携带者的效果与DC的活化程度有关，提示活化DC有利于治疗病毒感染。现有的绝大多数常规疫苗是由灭活的致病原或它们的亚单位组成，主要激活体液免疫，对细胞免疫作用较小，而DC却可以很好地解决这一问题。DC功能缺陷是新生儿对病原体易感的重要原因。研究显示，新生儿T细胞免疫功能低下可能与APC,特别是DC的异常有关：①脐血包含的髓系前DC较低，仅占DC的25%，而75%为淋巴系DC，后者不具备抗原捕获能力 ；②脐血DC表达的MHCⅠ、Ⅱ类分子及CD40、CD80、CD1a、ICAM1减少，使其提供给T细胞的双重刺激信号减少，刺激alloT增殖能力下降；③新生儿IFNγ基因CPG位点高度甲基化［11］，致使IFNγ产生减少，IFNγ选择TATA依赖性启动子引起IL12合成作用减弱。有生物学活性的IL12（P35）合成缺陷反过来也使T细胞分泌IFNγ水平下降，导致T细胞反应低下。因此，我们可以通过改善DC的功能和提高新生儿体内IFNγ的水平来提高新生儿的免疫功能。在抗病毒感染中，DC提呈的MHC多肽的半衰期短，CTL反应的效率较低，因此，要保持持久高水平的抗病毒免疫反应需要致敏的DC重复刺激机体。为使DC持续提呈病毒抗原多肽，选择合适的基因载体，将病毒抗原多肽基因导入DC中，使DC持续表达基因产物，可长期有效地诱导CTL反应。值得注意的是，DC也可能成为病毒的宿主细胞，如CMV。HIV1感染的DC能表达HIV1进入细胞的协同受体（CXCR4和CCR5），将病毒传递给CD4+ T细胞，诱导T细胞凋亡。麻疹病毒感染后可干扰DC和T细胞功能，诱导DC调亡和合胞体形成，从而将病毒传染给未感染的细胞。

    3.2  DC与变态反应性疾病正常人皮肤、肺脏、鼻黏膜及血液循环中都有IgE Fc受体（Fc ε RI） 阳性的DC 存在,在变态反应性疾病如哮喘病儿的肺脏中Fc ε RI 阳性DC 的数量增加,异位性皮炎皮损中分离到的LC表面Fc ε RI分子的数量增加,变态反应性疾病病变组织的炎症环境又会进一步增加DC上的Fc ε RI。IgE和IL4对Fc ε RI的表达有调节作用。DC 上的Fc ε RI可优先促进Th0向Th2分化。变态反应性疾病的DC 中可能的治疗靶目标是Fc ε RI , 操作目标是抑制Fc ε RI 的细胞内在化或者抑制Fc ε RI 的信号传导。不同组织中的不成熟髓系DC（iDC）在病原体的刺激下可分化为DC1、DC2和DC3。RISSOAN等［12］ 认为髓系DC即DC1，淋巴系DC即DC2，分别诱导Th0分化为Th1细胞和Th2细胞。 DC3的主要功能是诱导免疫耐受。目前认为哮喘最主要的免疫异常为Th1/Th2 细胞比例和功能失衡，主要表现为Th2细胞数量增多和功能亢进，IL4、IL5、IL6、IL9、IL10、IL13等Th2类细胞因子分泌增加，直接导致气道病理学特征的改变。而IFNγ、IL2、IL12等Th1类细胞因子分泌减少。IL12是目前已知的特异性最强的诱导Th0向Th1分化的最关键细胞因子［13］。DC分泌足够的IL12，诱导Th0细胞向Th1细胞分化，分泌IFNγ。可以考虑通过调节DC1 /DC2的平衡来调节Th1/Th2失衡对哮喘病儿进行治疗。研究发现，甲基泼尼松龙在体内可有效地抑制IL4和IL10的分泌，对IFNγ和IL12的抑制作用弱，从而部分纠正Th1/Th2的失衡，有利于病情的好转。有研究显示，在激素吸入疗法治疗哮喘中，糖皮质激素可以剂量依赖的方式诱导iDC分化为DC3，起诱导免疫耐受的作用，抑制免疫反应的维持与扩大［14］。动物实验发现，CTLA4胞外区与IgG1的C区融合后形成的CTLA4 Ig可以抑制气道高反应性及IgE过高分泌，防治哮喘，且吸入治疗对全身影响小，无明显副作用，因此吸入治疗哮喘是较好的选择［15］。可以诱导DC（如经IL10处理）使之处于特殊状态，促进Th0向Th3和调节性T细胞（Tr）转化，达到免疫耐受。新近研究发现，气道CD11c +DC可能介导吸入性抗原的免疫耐受,DC通过协同刺激分子ICOSL (B7rp1) 可以诱导产生能分泌IL10 的CD4+/CD25+Tr［16］ , Tr可完全抑制哮喘的气道炎症,这是目前哮喘研究的热点之一。因此,如何增强气道DC 诱导免疫耐受的作用,将成为DC作为靶细胞治疗哮喘的重要策略之一。

    3.3  DC与1型糖尿病儿童糖尿病90%以上为1型糖尿病。1型糖尿病为一种器官特异性自身免疫性疾病。Th1/Th2失衡和免疫耐受的破坏是其发病的重要环节。有文献报道，淋巴系DC是Th1反应的有效刺激物，而髓系DC则可增强Th2反应。因大量证据证实Th2反应可预防1型糖尿病的发生，而Th1反应则促进其发生，因而认为DC对糖尿病的促进或抑制作用可能缘于胰岛细胞抗原是被淋巴系DC还是被髓系DC提呈。TAKAHASHI等［17］已证实具有1型糖尿病危险的病儿，髓系DC存在缺陷。研究显示，NOD（nonobese diabetic）鼠DC存在发育缺陷，从而导致其自身耐受的破坏。不成熟DC易诱导免疫耐受，阻止DC的成熟，将促进胰岛抗原T细胞自反应性的下调。ZELLA等［18］证实维生素D及其类似物能预防NOD鼠自身免疫性糖尿病的发生，其机制与阻止DC的成熟有关。

    3.4  DC与系统性红斑狼疮(SLE)SLE的发生可能与细胞凋亡增加有关，凋亡细胞成为自身抗原的重要来源，其中，CD1+DC提呈内源性脂类和糖脂类抗原，刺激双阴性T细胞产生IL4，辅助B细胞分泌自身抗体。自身抗原抗体复合物作为IFNα的诱导剂，持续激活PDC产生IFNα，形成恶性循环，使IFNα不断升高，产生持续的病理损伤。RONNBLOM等［19］报道，SLE病人体内存在APC的功能缺陷和DC数量的减少，DC在外周血的比例与疾病的活动性呈负相关。DC减少的原因推测可能有：DC凋亡增加，活化的DC加速迁移到炎症组织。

    3.5  DC与白血病由于白血病是一类干细胞性疾病，几乎累及到所有的造血细胞系，而DC主要来源于CD34+祖细胞或单个核细胞（MNC），因此推测是否有可能从带有白血病相关基因及特异性基因的白血病干细胞中诱导分化出DC（如从PML/RAR γ融合基因的M3，bcr/abl融合基因的CML）。这种由白血病细胞来源的DC抗原性强，表达丰富的协同刺激分子（CD80和CD86），用其制成瘤苗，重新免疫病儿，可以克服某些免疫逃避机制，从而诱导特异性的CTL杀伤肿瘤细胞。CHOUDHURY等［20］先后用急性粒细胞白血病（AML）和慢性粒细胞白血病（CML）病人的单个核细胞，在细胞因子GMCSF、TNFα和IL4的作用下成功诱导出具有DC形态特征，并高表达HLADR、CD86和ICAM等的抗原，荧光原位杂交（FISH）和PCR证实其为白血病起源克隆细胞，实验证明其具有较强的T细胞刺激能力和很强的白血病细胞杀伤能力。WILLEN等［21］分离CML病儿骨髓CD34+细胞，用GMCSF、TNFα和IL4等细胞因子共同培养，也获得同样的结果。部分白血病病儿复发或难治的主要原因是存在微小残留病（MRD）。如何清除 MRD对提高化疗和自体造血干细胞移植治疗白血病的疗效有极为深远的意义。清除MRD的理想方法应是：在体内外最大限度产生特异性抗肿瘤效应，作用强、持久而彻底清除MRD，达到长期治愈目的；而对造血干细胞无损害，不影响移植后造血与免疫功能重建，甚至具有加速造血与免疫重建的作用。DC使得CTL最大限度发挥特异性抗肿瘤效应成为可能，是理想的体内外清除MRD的方法。 OSMAN等［22］用正常供者的外周血单核细胞，先后加入GMCSF、IL4及TNFα体外培养 1周，诱导出DC，在 DC中加入CML特异性 b3a2b 肽，加肽的DC作为效应细胞， 靶细胞则是加入b3a2b肽的供者自身T细胞以及与该供者HLA相合的移植后复发的CML病人的骨髓细胞。结果表明，加肽的DC能在体外发挥强有力的抗自体加肽靶细胞以及CML骨髓细胞的细胞毒杀伤效应，而与之相对照的是，无论DC中加或不加b3a2b肽，都不能发挥抗未加肽的自身靶细胞的细胞毒效应，说明这种细胞毒效应是有肽特异性的。正常供者肽特异性DC有望用于临床，通过清除体内MRD来治疗HLA相合异基因移植后复发的CML病人。

    3.6  DC与肿瘤［23］肿瘤细胞抗原提呈功能的缺陷及协同刺激分子的缺失是肿瘤逃避机体免疫的主要机制。①肿瘤细胞与DC融合得到的杂交瘤苗既能表达MHCⅠ、MHCⅡ、协同刺激分子，又具有加工、处理和提呈肿瘤特异性抗原的能力，激发肿瘤特异性CTL反应。②肿瘤抗原肽冲击DC，具有较好的靶向性，且肿瘤抗原浓度大，可有效激活T细胞，但肿瘤抗原冲击DC 的方法受到很多限制,包括: 大部分肿瘤的特异性抗原尚未明确，肿瘤发生的抗原改变能抵抗单一抗原的免疫攻击。为解决上述问题,可利用超声波破碎或反复冻融等方法制备肿瘤细胞性抗原冲击DC，该方法不要求具体的抗原识别表位,适于多种肿瘤,可避免某些变异株或缺陷株的免疫逃逸和继发转移。③肿瘤细胞RNA 冲击DC具有以下特点: 不需明确肿瘤特异性抗原；通过PCR扩增肿瘤RNA 或相应的cDNA 文库,可降低肿瘤组织的需求量,还可提高或纯化肿瘤相关抗原在DC 表面的浓度,提高肿瘤免疫反应的强度；用差异筛选法或减数杂交等方法筛选出肿瘤特异性mRNA ,冲击DC 或直接导入DC来治疗肿瘤,增强抗肿瘤免疫,避免自身免疫病。④基因修饰DC 抗肿瘤免疫治疗主要有：将肿瘤抗原基因导入DC ,使其在DC内持续表达肿瘤抗原,肿瘤抗原与DC 的MHCⅠ类分子结合,提呈给CTL ,在体内诱发特异性抗肿瘤免疫。还包括细胞因子基因和趋化因子基因的导入，有利于DC刺激CTL，提高DC的抗肿瘤免疫。疫苗佐剂可以提高疫苗接种的效率和细胞免疫效果。R 848 及其衍生物可作为有效的DC 疫苗佐剂用于细胞免疫治疗。

    3.7  DC与器官移植器官移植中，采用转染率高的腺病毒或表达持续时间长的反转录病毒为载体，将具有诱导耐受作用的免疫抑制分子的靶基因转染给供体DC 并使其表达,从而阻断或干扰DC 的抗原提呈功能，避免或减轻排斥反应，延长移植物存活时间。采用缺乏协同刺激分子的DC也可诱发免疫耐受。还有实验证明，细胞因子IL4、TGFβ1及血管内皮生长因子（VEGF）体外培养的DC可使移植物存活时间明显延长。抗原提呈过程中，DC若带有使T细胞发生凋亡的因子则可使抗原特异性T细胞发生凋亡，从而诱导免疫耐受。MIN 等［24］将凋亡因子Fas 的配体FasL 基因转染小鼠DC 后，输注给MHC 完全错配的受体,可明显延长心脏移植物存活时间。其机制可能为：通过供体DC 上高表达的FasL 与受体抗原特异性T 细胞上的Fas 相互作用诱导受体T 细胞发生凋亡,从而使受体对供体移植物特异性的反应低下或耐受。胸腺内的DC是T细胞进行阴性选择的最重要细胞，通过克隆排除CD4+、CD8+胸腺细胞及使T细胞无能而诱导免疫耐受［12］。未来须就DC 的成熟和亚群研究，DC 的输注途径、时间、剂量，DC 的诱导免疫耐受机制做进一步研究,为临床器官移植提供更为有效的抗排斥反应的途径。综上所述，脐血CD34细胞经GMCSF、TNFα及早期细胞因子SCF、FL、TPO等扩增诱导获得大量DC，必将为DC的基础研究及感染性疾病、肿瘤、自身免疫性疾病、过敏性疾病、器官移植等多种疾病的防治翻开新的一页。

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   （1  青岛大学医学院附属医院小儿内科，山东 青岛  266003；  2  莒县人民医院儿科）

　 （本文编辑  黄建乡）