AR基因启动子区C106T多态性与糖尿病肾病的相关性

    ［摘要］  ①目的  探讨染色体7q35区醛糖还原酶(AR)基因启动子区C106T多态性与2型糖尿病肾病(DN)相关性。②方法  运用聚合酶链反应限制性片段长度多态性技术(PCRRFLP)、DNA测序技术及高浓度琼脂糖凝胶电泳分离技术,对139例按尿微量清蛋白排泄率(UAER)分为早期DN组(DN+组，61例)和非DN组(DN-组，78例)2型DM病人的AR基因启动子区C106T多态位点的等位基因和基因型进行了检测，并以63例健康成人作为对照(CON组)。③结果  AR基因启动子区C106T多态位点存在T、C两种等位基因和CC、CT、TT三种基因型，DM组T、C等位基因频率和CT、CC基因型频率与CON组差异无显著性(χ2=1.77、1.23,P>0.05);DN+组T等位基因频率和CT基因型频率明显高于DN-组和CON组(χ2=8.63～12.71,P<0.01),C等位基因频率和CC基因型频率明显低于DN-组和CON组(χ2=8.42～14.10,P<0.01)。④结论  AR基因启动子区C106T多态性与糖尿病肾病的发生、发展有关。

　　［关键词］  糖尿病，非胰岛素依赖型；糖尿病肾病；醛糖还原酶；基因频率

    THE CORRELATION BETWEEN POLYMORPHISM OF ALDOSE REDUCTASE GENE AND DIABETIC NEPHROPATHYCHEN WENHUA(Department of Geratology, The Affiliated Hospital of Yanbian University, Yanji 133000,  China)

　　［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the relationship between polymorphism of C106T at promotor region of aldose reductase(AR) gene in chromosome 7q35 and nephropathy with type 2 diabetes in north China. MethodsA casecontrol study was conducted in 202 Chinese (including 139 cases of type 2 diabetes mellitus with or without nephropathy and 63 normal control subjects). The genotypes and alleles of polymorphism of C106T at promotor region of AR gene were determined by polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism(PCRRFLP) and 4% agarose gel electrophoresis. ResultsThe frequency of the T allele and CT genotype at promotor region of AR gene was significantly higher in DN+ group than that in DN and control(CON) groups (χ2=8.42-14.10,P<0.05),but there was no significant difference between DM and CON groups (χ2=1.77,1.23; P>0.05).ConclusionThe polymorphism of the C106T at promotor region of aldose reductase gene is related to the occurrence and development of diabetic nephropathy.

　　［KEY WORDS］diabetes mellitus, noninsulindependent; diabetic nephropathies; aldose reductase; gene frequency

    糖尿病肾病(DN)是糖尿病(DM)常见的慢性微血管并发症，为终未期肾衰竭的主要病因，也是DM病人致死、致残的主要原因。遗传因素在DN的发生和发展中起重要作用。醛糖还原酶（AR）是多元醇通路的关键酶，该酶活性升高与糖尿病微血管并发症的发生、发展有关。但编码该酶的基因变异与DN的相关性各家报道不一［1~4］。本研究检测了139例2型DM病人及63例健康成人AR基因启动子区C106T多态性，以探讨AR基因变异与DN的相关性。

    1  对象与方法

    1.1  研究对象

    1.1.1  2型DM组  本组139例,均选自延边大学附属医院内分泌老干部科住院及门诊病人,诊断参照1999年WHO关于DM诊断和分类标准。病程超过10年，血压基本在正常范围。根据24 h尿微量清蛋白排泄率(UAER)分为两亚组。早期DN组(DN+组)：61例，6个月内连续测定两次UAER均为20~200 μg/min，且血肌酐(Cr)<120 μmol/L，并排除由心脏、肝脏、其他全身疾病或原发泌尿系统疾病及应用影响肾功能药物引起微量清蛋白尿者，男24例，女37例;年龄49~77岁，平均(63.89±7.28)岁;病程10~20年，平均(14.12±2.61)年。非DN组(DN-组)：78例，6个月内连续两次UAER<20 μg/min，且血肌酐<120 μmol/L，男30例，女48例；年龄48~78岁，平均(64.13±6.58)岁；病程10~20年，平均(14.07±2.12)年。两组间性别、年龄、血压等差异无统计学意义。见表1。

    1.1.2  正常对照组(CON组)  共63例，为体检健康成人，经检查除外糖尿病、冠心病、高血压、高血脂、肾脏疾病，男24例，女39例；年龄50~78岁，平均(64.11±7.21)岁。

    1.2  实验方法

    1.2.1  临床及生化指标检测  所有研究对象均测量身高、体质量，计算体质量指数(BMI)。葡萄糖氧化酶法测血糖，全自动生化分析仪测血脂，高压液相法测糖化血红蛋白，电化学发光法测胰岛素，ELISA法测24 h尿微量清蛋白含量。

    1.2.2  外周血白细胞基因组DNA提取  采用Promega公司生产的全血DNA抽提试剂盒，-4 ℃保存。

    1.2.3  AR基因启动子区C106T多态基因型的检测  5′及3′端引物序列为：5′TAGGACCAGGCGGAAGAAGCATC3′,5′TGGCGCCGTTGTTGAGCAG3′；反应条件为：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循环35次后于72 ℃终延伸5 min。20 g/L琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，并用限制性内切酶Bfa  Ⅰ酶切。酶切产物经40 g/L琼脂糖凝胶电泳，用DNA Marker DL2000作对照，通过紫外线透射仪观察结果。

    1.2.4  DNA测序  随机抽取PCR产物进行DNA测序，对测序结果和PCR酶切结果进行比较，以证实PCR及酶切结果的准确性。

    1.3  统计学处理各组间基因型频率和等位基因频率的比较用χ2检验，正态分布资料用±s表示；统计分析用SPSS 11.0软件完成。

    2  结    果

    2.1  AR基因启动子区C106T多态性不含突变等位基因者，Bfa  Ⅰ酶切后得到大小为178 bp和59 bp的两个片段，为纯合子TT基因型；含T→C突变等位基因，酶切后仅见237 bp片段，为纯合子CC基因型；酶切后既有237 bp片段，又有178 bp和59 bp片段者，为杂合子CT基因型。DNA测序证实PCRRFLP结果可靠（图1）。

    2.2  2型DM病人AR基因启动子区C106T不同基因型的临床和生化特征比较139例DM病人中，CC基因型93例,男35例,女58例；CT+TT基因型46例，男19例，女27例。DN+组TT基因型2例，DN-组TT基因型1例，因样本例数太少统计时与CT基因型合并。CC基因型组和CT+TT基因型组病人的年龄、病程、BMI、血压、血糖、胰岛素、血脂差异均无显著性。

    2.3  AR基因启动子区C106T多态的等位基因频率和基因型频率DM组T、C等位基因频率和CT、CC基因型频率与CON组差异无显著性(χ2=1.77、1.23,P>0.05);DN+组T等位基因频率和CT基因型频率明显高于DN-组和CON组(χ2=8.63、12.71,P<0.01),C等位基因频率和CC基因型频率明显低于DN-组和CON组(χ2=8.42、14.10，P<0.01)。研究对象各等位基因频率经χ2检验符合HardyWeinberg遗传平衡定律，说明所研究人群有群体代表性。见表2。表1  DN+组与DN－组临床资料比较 表2  AR基因启动子区C106T多态的各种等位基因和基因型频率

    3  讨    论

　　AR是多元醇通路的限速酶，该酶的活性升高在DN的发生、发展中起重要作用。生理状态下，该酶的活性不高，但在DM时细胞内高糖环境可激活AR，导致细胞内生成大量的山梨醇,由于山梨醇不能自由透过细胞膜，其在细胞内积聚所引起的渗透压升高，可导致细胞水肿和死亡；此外，被激活的AR在催化反应过程中消耗大量的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸辅酶Ⅱ(HADPH)，HADPH/HADP+下降，使细胞内氧化还原失衡，细胞清除自由基的能力下降，最终导致病变的发生、发展。在体内AR的活性受许多因素的影响，编码AR的基因变异所导致的基因异常表达是影响AR活性的重要因素之一。1998年Imperatore等［1］采用受累同胞对研究方法,对Pima Indian人中的2型DM病人进行大样本的基因组扫描，结果显示，染色体7q35区与DM微血管并发症相关联。AR基因位于7q35区，其基因变异与DN的相关性引起了国内外学者的广泛关注。NeamatAllah等［2］研究结果显示，AR基因多态与1型DM病人DN有关，但与2型DM病人DN的发生无关。Fanelli［3］等研究显示,白人和印地安人AR基因多态与1型DM病人视网膜病变发生有关，与DN无关，日本学者对日本1型DM病病人的研究却得出完全相反的结论［4］。中国学者研究显示，2型DM病人AR基因启动子区(CA)n片段长度多态与DN的发生有关［5］。AR基因启动子区尚存在C106T多态，与上述研究相似，该多态与DN的相关性各文献也报道不一［2~4］。究其原因可能与研究对象和对照组选择不同有关。DN为一多基因遗传性疾病，是遗传因素和环境因素共同作用的结果。业已证实高血压和血糖长期控制不良是DN的独立危险因素，特别是高血压对DN的发生和发展起至关重要的作用。但在既往的研究中仅修正了病程和血糖对DN发生的影响，忽略了高血压的作用，研究对象血压跨度较大，导致AR基因多态与DN的相关性结论不一。本研究在设计上充分考虑到血压等环境因素对DN的影响，所选研究对象病程虽均大于10年，但血压基本正常，代谢控制水平也基本相似，目的是尽可能减少环境因素的作用，以观察遗传因素对2型DM病人DN发生的影响。结果显示，DN病人的AR基因启动子区T等位基因频率及CT基因型频率显著高于非DN病人和对照组，携带T等位基因的2型DM病人DN的发生率是非T等位基因携带者的3.75倍(Ratio)。提示该基因多态与DN有关。本研究显示，正常人群中AR基因启动子区也存在C106T多态，但24 h尿微量清蛋白排泄率在正常范围，提示即使携带T等位基因，只要代谢控制良好也不发生DN，进一步说明了DM病人血糖、血压和血脂等长期良好控制的重要性。本文139例病史长达10年、血压基本正常、代谢控制基本相似的139例2型糖尿病病人中只有61例发生DN，另78例未发生肾脏早期损害，发生DN者携带的T等位基因、CT基因型频率明显高于DM非DN病人，提示AR基因启动子区C106T多态与DN+遗传易感性有关，携带T等位基因的2型DM病人更应加强对代谢紊乱的控制，以延缓或阻止DN的发生。

    ［参考文献］

    ［1］IMPERATORE G, HANSON R L, PETTITT D J, et al. Sibpair linkage analysis for susceptibility genes for microvascular complications among Pima Indians with type 2 diabetes［J］. Diabetes, 1998,47:821.

    ［2］NEAMATALLAH, FEENEY S A. Analysis of the association between diabetic nephropathy and polymorphism in the aldose reductase gene in type 1 and type 2 diabetes mellitus ［J］. Diabet Med, 2001,18(11):906.

    ［3］FANELLI A, HADIADJ S. Polymorphism of aldose reductase gene and susceptibility to retinopathy and nephropathy in Caucasians with type 1 diabetes［J］. Arch Mal Coeur Vaiss, 2002,95(78):701.

    ［4］YAMAMOTO  T, SATO  T, FEE S, et al. Aldose reductase gene polymorphism is associated with progression of diabetic nephropathy in Japanese patients with type Ⅰ diabetes mellitus［J］. Diabetes Obes Metab, 2003,5(1):51.

    ［5］LIU Y F, WAT N M, YA H, et al. Diabetic nephropathy is associated with the 5′end dinucleotide repeat polymorphism of the aldose reductase gene in Chinese subjects with Type 2 diabetes［J］. Diabet Med, 2002,19(2):113.

   （延边大学附属医院老干部科，吉林 延吉  133000）

　 （本文编辑  黄建乡）