乳酸杆菌与肠上皮细胞黏附作用的研究

【摘要】  目的 研究乳酸杆菌与肠上皮细胞的黏附作用，以及乳酸杆菌的耗尽培养上清液对其黏附性的影响。方法 用光镜和电镜技术分析不同时相乳酸杆菌与肠黏膜上皮细胞的黏附指数，同时观察了乳酸杆菌的耗尽培养上清液对黏附指数的影响。结果 乳酸杆菌对肠上皮细胞具有较强的黏附性。与新鲜LBS培养液悬浮组相比，耗尽培养上清液能使乳酸杆菌对肠上皮细胞的黏附指数增加（t=3.67,P<0.01）。结论 乳酸杆菌是具有潜在开发价值的微生态制剂。

【关键词】  乳酸杆菌；细菌黏附；耗尽培养上清液

    A STUDY ON LACTOBACILLUS ADHESION TO INTESTINAL EPITHELIUM SI YUANGUO， GAO JING  (Clinical Laboratory of Qingdao Hiser Medical Center, Qingdao 266033, China) ［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the adhesive ability of  lactobacillus to enterocytes and the effects of spent culture supernatant of lactobacillus on it. MethodsThe adherence index of lactobacillus was observed microscopically and electron microscopically. The effects of spent culture supernatant on lactobacillus adherence index was analyzed.ResultsLactobacillus had good adhesive abilities to enterocytes. Spent culture supernatant of lactobacillus can strengthen adhesive ability of lactobacillus to enterocytes (t=3.67,P<0.01）. ConclusionLactobacillus is a potentially valuable microecological preparation.

    ［KEY WORDS］lactobacillus; bacteria adherence; spent culture supernatant

    乳酸杆菌是人体肠道的主要益生菌，在维持和调节人体内微生态平衡、抑制病原微生物侵袭、调节免疫防御、防止多种疾病和不良反应的发生方面具有重要的作用[1]。 黏附是益生菌发挥作用的首要条件，对肠黏膜上皮细胞黏附后构成的生物屏障，可阻止致病菌的入侵和定植。益生菌抵御外籍菌定植所表现出的定植抗性是衡量其生态效应的重要指标。本文对人体肠道主要益生菌乳酸杆菌与肠黏膜上皮细胞的黏附性，以及乳酸杆菌的耗尽培养上清液对其黏附性的影响进行了研究，旨在探讨乳酸杆菌在微生态制剂开发中的价值。

    1  材料和方法

    1.1  材料

    1.1.1  菌种和细胞  乳酸杆菌由本室保存；人肠黏膜上皮细胞Lovo细胞由本室保存。

    1.1.2  培养基  嗜酸乳杆菌用LBS培养基培养；细胞培养基RPMI1640为美国GIBCO公司产品。

    1.2  方法

    1.2.1  细菌培养  将乳酸杆菌接种于LBS培养基，37 ℃厌氧培养48 h后收集菌体，用PBS将细菌悬液调至1×1011 CFU/L。

    1.2.2  乳酸杆菌与肠黏膜上皮细胞的黏附实验Lovo细胞接种于含体积分数0.10小牛血清不含抗生素RPMI1640培养液的6孔培养板（GIBCO公司）内，于体积分数0.05 CO2培养箱中37 ℃培养至细胞密度达80%，加入终浓度为1×1011 CFU/L乳酸杆菌，于体积分数0.05 CO2 37 ℃环境中共生培养，分别于1、2、3 h终止培养，取出玻片,用DHank液洗涤3次,以去除未黏附的益生菌。用甲醇固定15 min，革兰染色，油镜下随机选择50个细胞，计算其可视性细胞表面的益生菌。黏附实验重复3次，运用统计学方法计算黏附指数。黏附指数=黏附细菌数/细胞数×100%。

    1.3  益生菌耗尽培养上清液的制备

    将嗜酸乳杆菌、双歧杆菌和肠球菌分别接种于LBS 、BS和EC培养基，37 ℃厌氧培养48 h，4 ℃下4 000 r/min 离心10 min，收集上清液，制备成耗尽培养上清液。

    1.4  耗尽培养上清液对乳酸杆菌黏附作用的影响

    Lovo细胞与乳酸杆菌的培养，参照以往的方法进行[2]，并加以改进。将乳酸杆菌悬液用PBS洗2次离心后，弃PBS上清液，分别用耗尽培养上清液、新鲜LBS培养液，于体积分数0.05 CO2 37 ℃环境中与Lovo细胞共生培养1 h，观察其黏附情况。

    1.5  统计分析

    每次实验均重复3次，实验结果以±s来表示，以SAS软件作统计学分析。

    2  结    果

    2.1  乳酸杆菌对Lovo细胞的黏附作用

    1、2、3 h乳酸杆菌对肠上皮细胞黏附指数分别为8.15±1.08、7.98±1.25、8.21±1.16。

    2.2  代谢乏液对乳酸杆菌黏附作用的影响 

    新鲜LBS培养液悬浮组、耗尽培养上清液组黏附指数分别为2.15±1.19、9.05±1.46，两组比较差异有显著性(t=3.67,P<0.01)。

    3  讨    论

    黏附是病原菌感染的第一步，在这一过程中细菌表面的黏附素与宿主黏膜上皮细胞表面的互补性黏附素受体通过化学键结合，进而表达毒力因子，作用于被感染的宿主细胞使其发生病变。黏附是益生菌发挥作用的首要条件，因此，益生菌的定植抗性是衡量其生态效应的重要指标。BERNET等[3]研究表明，双歧杆菌黏附于肠黏膜上皮细胞，可抑制致病菌对肠上皮细胞的侵袭作用，黏附后的双歧杆菌发挥了占位性保护作用。COCONNIER 等[4]认为，具有黏附特性的乳酸杆菌竞争性抑制肠毒性大肠杆菌对Coca2细胞的黏附作用是通过空间位阻作用实现的。

    本研究显示，乳酸杆菌对肠上皮细胞Lovo细胞具有较强的黏附性。这一结果为深入研究益生菌的黏膜免疫调节作用及其抗肿瘤机制等奠定了基础。本实验结果亦显示，新鲜LBS培养液使乳酸杆菌的黏附指数显著下降，说明耗尽培养上清液中存在与黏附相关的黏附素成分。郑跃杰等[5]认为，双歧杆菌黏附素可能是一种不耐热的蛋白质，主要存在于耗尽培养上清液中。

    关于益生菌对肠道致病菌的黏附抑制作用的机制，目前公认的观点是：乳酸杆菌、双歧杆菌等益生菌定植于肠黏膜上皮细胞以后，在肠黏膜表面形成一层生物菌膜，可抑制致病菌黏附至肠黏膜；产生的代谢产物如乳酸、乙酸、丙酮酸等有机酸可显著降低肠道pH值和肠道还原电势，对许多病原微生物具有抑制作用；益生菌代谢过程中产生的过氧化氢、细菌素以及生物表面活性物质等具有一定的抑菌效果；益生菌黏附于肠黏膜上皮细胞可上调细胞表面黏蛋白表达，使宿主细胞产生黏附拮抗物质，由此抑制病原菌的黏附。

【参考文献】
  [1]CROSS M L. Immunesignalling by orallydelivered probiotic bacteria: effects on common mucosal immunoresponses and protection at distal mucosal sites[J]. Int J Immunopathol Pharmacol, 2004，17:127134.

[2]伦永志,黄敏,袁杰利，等. 灭活的双歧杆菌对肠上皮细胞黏附及其影响因素的研究[J]. 中国微生态学杂志, 2000，12（6）：314316.

[3]BERNET M F, BRASSART D, NESSER J R, et al. Adhesion of human bifidobacterial strains to cultured human intestinal epithelial cells and inhibition of enteropathogencell interactions[J]. Appl Envion Microbiol, 1993, 59(12):41214128.

[4]COCONNIER M H, BERNET M F, KEMEIS S, et al. Inhibition of adhesion of enteroinvasive pathogens to human intestinal Coca2 cells by Lactobacillus acidophilus strain LB decreases bacterial invasion[J]. FEMS Microbiology Letters, 1993，110:299305.

[5]郑跃杰，潘令嘉. 双歧杆菌对肠上皮细胞黏附的研究[J]. 中华微生物学和免疫学杂志， 1997，17（2）：8587.

作者单位：（1 青岛市海慈医疗集团检验中心，山东 青岛 266033； 2 青岛市中心医院检验中心）