CyclinD1与P27在卵巢上皮性肿瘤组织表达及意义

【摘要】  目的 探讨CyclinD1、P27在卵巢上皮性肿瘤组织表达及其意义。方法 应用组织微阵列技术结合免疫组化(PV9000法)检测57例卵巢癌、15例卵巢交界性肿瘤、33例卵巢良性上皮性肿瘤、18例正常卵巢组织中CyclinD1、P27的表达，并分析其与上皮组织良恶性、病理组织分级、临床分期的相关性。结果 正常卵巢组织和卵巢良性肿瘤组织间及交界性肿瘤组织和卵巢癌组织间CyclinD1、P27的表达无明显差异(χ2=0.001～3.677,P>0.05)；CyclinD1在卵巢癌组织中的表达显著高于卵巢良性上皮性肿瘤(χ2=11.314,P<0.01)，且随肿瘤分级、分期增高，阳性表达率逐渐升高(χ2=7.887、4.859,P<0.05)，而P27的表达则相反(χ2=7.467、6.091,P<0.01)；CyclinD1、P27表达与肿瘤的组织学类型无关(χ2=0.475、1.512,P>0.05)，两者在肿瘤组织中的表达呈明显负相关（r=-0.96,P<0.05）。结论 CyclinD1过表达、P27表达下降可能在卵巢癌的发展过程中起重要作用，检测CyclinD1、P27在卵巢癌组织表达可预测该肿瘤生物学行为特征，作为预后参考指标。

【关键词】  卵巢肿瘤 P27 CyclinD1 免疫组织化学 芯片分析技术

    THE EXPRESSION AND ITS SIGNIFICANCE OF CyclinD1 AND P27 IN EPITHELIAL OVARIAN TUMORSYAN WENXIU, YU JIANXIAN， SUN YUJUAN,  et al(Department of Pathology， Qingdao Municipal Hospital, Qingdao 266011, China) ［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the expression of CyclinD1 and P27 in epithelial tumor of ovary and its significance. MethodsThe expression of CyclinD1 and P27 in tussues of ovarian cancer (57 cases), borderline ovarian tumors (15), benign tumor of ovary (33), normal ovary (18) were examined by immunohistochemistry and tissue microarray technique. Their correlation with clinical pathology was analyzed.ResultsThere were no significant differences of CyclinD1 and P27 expression between benign and normal ovarian tissues, borderline ovarian tumors and epithelial ovarian cancer (χ2=0.001-3.677,P>0.05). The expression of CyclinD1 and P27 was significantly different between epithelial ovarian cancer and benign ovarian tumors (χ2=11.314,9.130;P<0.01). The expression of CyclinD1 and P27 was in connection with clinical stage and histological grade (χ2=4.859-7.887,P<0.05). There was no relationship between CyclinD1 and P27 expression and pathological type (χ2=0.475,1.512;P>0.05). Expression of CyclinD1 was negatively correlated with expression of P27 (r=-0.96, P<0.05).ConclusionDetection of P27 and CyclinD1 expression in ovarian cancer may predict the biological behavior and the prognosis of the disease.

    ［KEY WORDS］ovarian neoplasms; CyclinD1; P27; microchip analytical technique; immunohistochemistry

    卵巢恶性上皮性肿瘤是常见的妇科肿瘤之一，由于其生物学行为的特殊性，使其在早期易发生多途径、多部位转移，故其病死率居妇科恶性肿瘤首位。组织微阵列(TMA) 又称组织芯片，是1998年KONONEN等[1]在基因芯片、蛋白质芯片的启发下提出的又一种重要生物芯片技术。它可将数十、数百甚至上千个微小的不同临床组织集成到一张载玻片上，制成有序的微缩组织切片，从而在一次实验中即可获得大量结果。本研究采用组织微阵列技术制作卵巢上皮性肿瘤的组织微阵列，并用免疫组织化学技术进行细胞周期蛋白CyclinD1和细胞周期素依赖性激酶抑制蛋白P27的检测,探讨卵巢上皮性肿瘤组织中P27、CyclinD1的表达及意义。

1  资料与方法

    1.1  一般资料

    收集青岛市市立医院2002年1月～2006年8月间手术切除的卵巢上皮性肿瘤及正常卵巢组织标本，共123例。每例均有详细的临床资料及手术记录，术前均未接受化疗和放疗。病人年龄14～78岁，中位年龄46岁。123例中，上皮性卵巢癌57例,卵巢交界性肿瘤15例，卵巢良性肿瘤33例，正常卵巢组织18例。全部病例均经病理专家复诊并参考《阿克曼外科病理学》进行病理组织学分类和病理分级[2]。组织学类型:浆液性囊腺癌26例，黏液性囊腺癌11例，子宫内膜样癌17例，透明细胞癌3例。病理学分级：1级19例，2级17例，3级21例。所有标本经中性甲醛溶液固定，石蜡包埋，4 μm厚切片。

    1.2  组织微阵列制备    ①载玻片的准备：载玻片经过清洁液浸泡，充分水洗并烘干，用100 g/L多聚赖氨酸处理载玻片，烘干备用。②组织芯片模块的制备：将熔化石蜡制作 4.0 cm×2.0 cm×1.0 cm 大小的空白蜡块。设计9×7点组织列阵，用打孔仪制成模块。③对供体组织苏木精伊红染色切片作形态学观察并在供体蜡块上准确标记所需要的靶点。④利用打孔仪钻取靶点组织，并转移至受体蜡块相应的孔位上,即制成所需的阵列蜡块，取样针直径1.5 mm，共制作2个组织芯片蜡块。⑤已制备好的组织微阵列蜡块连续4 μm 厚切片，裱贴于经多聚赖氨酸处理过的载玻片上，37 ℃恒温箱中放置12 h，常温保存备用。各取1张进行苏木精伊红染色供形态学观察。

    1.3  组织微阵列免疫组化标记

    方法采用非生物素化辣根酶标记免疫组织化学染色法(PV 9000)。兔抗人CyclinD1单克隆抗体、鼠抗人P27单克隆抗体及PV 9000免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。主要染色步骤参照试剂盒说明书进行，抗原修复均采用微波修复法。以已知阳性片作阳性对照，以同种动物非免疫血清代替一抗作阴性对照。

    1.4  结果判定

    P27在正常卵巢组织和卵巢肿瘤组织中的表达主要位于细胞核，棕黄色颗粒为阳性。CyclinD1在正常卵巢和卵巢肿瘤组织细胞胞浆、胞核均有表达,棕黄色颗粒为阳性。综合细胞染色强度和阳性细胞计数进行半定量分析，判断标准如下。①按细胞显色有无和深浅计分：无显色计0分，浅黄色计1分，棕黄色计2分，黄褐色计3分；②按显色细胞的比例计分：显色细胞<10%计0分，10%～25%计1分，26%～50%计2分，51%～100%计3分。以两者计分的和作为判断标准：0分阴性(-)，1～2分弱阳性(+)，3～4分阳性()，5～6分强阳性()。每张切片至少观察5个视野。在分析时将“+”以下视为低表达，“”以上视为高表达[3]。

    2  结    果

    2.1  卵巢上皮性肿瘤组织CyclinD1和P27的表达

    制备成的组织芯片包含取自123例不同卵巢组织的石蜡标本，2例样本因脱片而不能进行统计,故实际有效样本数为121例。正常卵巢和卵巢良性肿瘤组织间，交界性肿瘤和卵巢癌组织间CyclinD1、P27表达差异均无显著性(χ2=0.001～3.677,P>0.05)，但在卵巢良性肿瘤组织和卵巢癌组织间CyclinD1、P27的高表达率差异有显著性(χ2=11.314、9.130,P<0.01)，在卵巢癌组织中CyclinD1表达增高，P27表达降低。CyclinD1在交界性肿瘤组织中的阳性表达率明显高于卵巢良性肿瘤，差异有显著性(χ2=4.473,P<0.05)，而P27在交界性肿瘤和卵巢良性肿瘤组织间的表达差异无显著性(χ2=1.629, P>0.05)。见表1。CyclinD1和P27在肿瘤组织中的表达呈负相关（r=-0.96, P<0.05）。表1  卵巢组织中CyclinD1和P27高表达比较［例（χ％）］组织类型nCyclinD1高表达P27高表达正常卵巢组织171（5.8）14（76.4）卵巢良性肿瘤332（6.1）25（75.8）卵巢交界性肿瘤144（28.6）8（57.1）卵巢癌5722（38.6）17（29.8）

    2.2  P27、CyclinD1在卵巢癌组织中的表达与临床病理特征的关系

    CyclinD1和P27表达在不同组织学类型卵巢癌之间比较，差异无显著性(χ2=0.475、1.512,P>0.05)。CyclinD1随着肿瘤分级、分期增高,高表达率升高 (χ2=7.887、4.859,P<0.05),而P27的表达则相反(χ2=7.467、6.091,P<0.05)。见表2。表2  CyclinD1和P27的表达与临床病理特征的关系

    3  讨    论

    自1998年KONONEN等提出组织微阵列的概念后，它就作为生命科学中进行原位组织学研究的重要技术而引起广泛重视，并逐渐成为分子病理学家看好的重要研究工具。应用组织微阵列既可做苏木精伊红染色、特殊染色和免疫组织化学染色，也可做DNA和RNA分子原位杂交、荧光原位杂交。它通过一次实验即可获得大量结果，具有高效、快速、低消耗的特点，而且对一次实验所获结果进行平行分析，可比性强,结果更具标准化。我们通过组织芯片技术对121例卵巢上皮性肿瘤及正常卵巢组织进行CyclinD1和P27的免疫组化检测，结果仅用几张切片即完成了全部实验，且染色背景清晰，很少出现边缘现象。极大节约了研究经费，降低了制作成本及劳动量，而且在最短的时间内获得了CyclinD1和P27在卵巢上皮性肿瘤组织中表达的全部数据。

    CyclinD1是一种细胞周期蛋白，在细胞增殖的调节中起重要作用，已被证实在众多人类恶性肿瘤的发生发展中担当重要的角色[4]。在所有Cyclin中，CyclinD1与肿瘤发生发展的关系最为密切。某些原癌基因如ras基因可与CyclinD1相互作用，以促进细胞的转化，过量CyclinD1可导致细胞失去对生长因子的依赖，以致发生恶变[5]。本实验通过对卵巢组织微阵列的免疫组化染色，显示CyclinD1在卵巢癌和卵巢交界性肿瘤组织中的阳性表达率均显著高于卵巢良性肿瘤，且随卵巢上皮性肿瘤恶性程度的增加CyclinD1阳性表达增强，提示CyclinD1可能在卵巢肿瘤的恶变过程中发挥重要作用。

    P27为重要的细胞周期抑制蛋白，通过多种方式参与细胞周期的调控，其最终结果是抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，诱导细胞分化。抑制CyclinCDK复合物的生物活性是P27参与细胞周期调控的主要方式。P27通过与CDK或CyclinCDK复合物的结合，实现对CDK活性的抑制，从而对细胞周期进行负调控。它既能抑制已与Cyclin结合并已激活的CDK，又能抑制CDK的激活过程。当P27与CyclinDsCDK结合时，抑制CDK活性,从而抑制pRb磷酸化，与pRb结合的转录因子E2F不能发挥其启动转录的活性，使细胞停滞于G1期，细胞生长停止。免疫组化检测和Westernblot分析发现，在正常卵巢和卵巢良恶性肿瘤中均有表达，但卵巢癌中P27表达明显低于正常卵巢、卵巢良性肿瘤和交界性肿瘤[6]，提示P27表达下降与卵巢癌的发生有关。本文结果显示，P27在卵巢恶性肿瘤中的表达率为29.8%，明显低于交界性肿瘤及良性肿瘤的表达率，与SUI等[7]报道结果相似。P27表达下降可能是由于逐渐增加的蛋白酶所介导的降解作用增强所致，而非基因突变，P27蛋白水平的调节主要发生于转录之后的翻译和降解过程。P27蛋白水平低下或缺失，其对细胞增生抑制作用相应下降，可导致细胞过度增殖，引起卵巢肿瘤发生。有学者报道，P27表达与多种肿瘤的病理特征有关，与肿瘤的预后呈正相关性[8]。已有研究表明 ，P27蛋白与核内的靶物质相互作用而发挥其抑制细胞增生等作用[9]。本研究结果显示，P27在临床Ⅲ～Ⅳ期卵巢癌中表达率显著低于临床Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌，低分化肿瘤中的表达率与高、中分化肿瘤比较显著降低，说明P27可能具有抑制卵巢肿瘤细胞增殖及诱导细胞分化的作用，与卵巢癌的发展密切相关。

    在卵巢癌组织中P27的表达下降与CyclinD1的过表达同时出现，反映了恶性程度较高、预后较差的肿瘤细胞内的一种自我平衡、反馈机制。本实验显示，在卵巢癌组织中，随着肿瘤分期、分级增高，P27表达降低,而CyclinD1的表达增高，两者呈负相关。

    综上所述，检测P27、CyclinD1在卵巢癌组织中表达(尤其是把P27、CyclinD1联合起来分析时)，有可能成为预测该肿瘤的生物学行为和判断病人预后的重要参考指标。

【参考文献】
  ［1］KONONEN J, BUBENDORF L, KALLIONIE A, et al. Tissue microarrays for high throughout molecular profiling of tumor specimens[J]. Nat Med, 1998,4(7):844847.

［2］回允中译. 阿克曼外科病理学[M]. 第8版.长春:辽宁教育出版社, 1999：14741475.

［3］江晨，崔琳，纪萍，等. 胃癌组织中HGF/cMet的组织芯片检测及其与肿瘤血管生成关系[J]. 齐鲁医学杂志， 2005，20（3）:214216.

［4］FU M, WANG C, LI Z, et al.CyclinD1:normal and abnormal functions[J]. Endocrinology, 2004,145(8):54395447.

［5］HUNTER T, PINES J. CyclinD and CDK inhibitors come of age[J]. Cell, 1994,79:573.

［6］VALERIA M, ALESSANDRO S, CARMEN P, et al. A frequent loss of expression of the cyclindepend kinase inhibitor P27 in epithelial ovarian cancer[J]. Cancer Res, 1999, 59:37903794.

［7］SUI L, TOKUDA M, OHNO M, et al. The concurrent expression of P27(kip1) and cyclinD1 in epithelial ovarian tumors[J]. Gynecol Oncol, 1999,73(2):202209.

［8］SUI L, DONG Y, OHNO M, et al. Implication of malignancy and prognosis of P27 (kip1), CyclinE, and CDK2 expression in epithelial ovarian tumors[J]. Gynecol Oncol, 2001,83(1):5663.

［9］王琳.子宫内膜癌组织Ｐ27蛋白的表达及其临床意义[J]. 青岛大学医学院学报， 2006，42(2):147149.

作者单位：青岛大学医学院附属青岛市市立医院，山东 青岛 266011