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【摘要】 目的 研究胃癌及癌旁粘膜中CyclinD1、CDK4的表达及意义。方法 采用流式细胞术测定32例胃癌，24例癌旁组织中CyclinD1、CDK4的表达。结果 胃癌CyclinD1、CDK4阳性表达分别为56.3%，53.1%。CyclinD1、CDK4阳性表达明显高于癌旁粘膜（P<0.01），CyclinD1在淋巴结转移性胃癌中阳性表达较高，而CDK4在转移性胃癌和未转移胃癌中表达差异无显著性（P>0.05）。结论 CyclinD1、CDK4表达特征与胃癌的发生、发展、生物学行为及其预后有密切关系。
carcinoma and pericarcinoma mucosa
Dong Qin，Kong Guangzhong，Ouyang Xiaohui，et al.
Department of General Surgery，First Affiliated Hospital，Inner Mongolia Medical College，Hohhot010050.
【Abstract】 Objective To study the expression of CyclinD1，CDK4and their significance in gastric carcinoma and pericarcinoma mucosa.Methods Flow cytometry（FCM）was used to detect the expression of CyclinD，CDK4in32cases of pericarcinoma mucosa.Results The positive rate of CyclinD1，CDK4in gastric carcinomata was56.3%and53.1%，respectively CyclinD1of gastric carcinoma was significantly higher than that of pericarcinoma mucosa（P<0.01）.The overexpression of CyclinD1was detected in gastric carcinomata with lymph node metastasis（P<0.05），and the expression of CDK4was similar in gastric carcinomata with lymph node metastasis and no metassis（P>0.05）.Concluˉsion The expressions of CycliD1，CDK4might be related to the carcinogenesis，development，biological behaviors and prognosis of gastric carcinoma.
Key words gastric carcinoma CylinD1 CDK4 flow cytometry
肿瘤组织的一个显著特征是细胞的失控性生长，肿瘤的发生和生长的控制与细胞周期的调节有关，一些癌基因和抑癌基因直接参与细胞周期的调节。近来研究发现CyclinD1、CDK4表达与一些恶性肿瘤的发生发展、生物学行为及预后有关 ［1］ 。本文应用流式细胞术及间接免疫荧光技术，对胃癌及癌旁组织的细胞周期蛋白类的表达进行研究，探讨其胃癌发生发展中的联系。
1 材料和方法
1.1 材料 32例胃癌及24例癌旁粘膜组织取自内蒙古医学院附属医院自2001年5月～10月临床手术切除的新鲜标本，其中高分化腺癌13例，中分化癌8例，低分化癌6例，未分化癌5例，伴有区域淋巴结转移的胃癌13例，无淋巴结转移的胃癌19例。另取10例远离手术切端的胃粘膜作为正常对照。所有病例术前均未做过化疗或放疗。32例胃癌中，男18例，女14例，平均年龄51岁。标本经剪碎法制成细胞悬液、70%酒精固定，置-80℃冰箱保存备用。
1.2 主要设备及试剂 流式细胞仪FACS420（BD、CO、USA）。鼠抗人CyclinD1单抗（1∶100），兔抗人CDK4单抗（1∶100），羊抗鼠FITC-IgG（1∶400），羊抗兔FITC-IgG（1∶400），试剂均购自美国SantaCruz公司。
1.3 实验方法及步骤
1.3.1 单细胞悬液的制备 （1）弃去固定剂:将剪碎的组织放在120目不锈钢网上，网下放一平皿，用眼科镊子轻搓组织，边搓边加PBS，直到组织搓完为止。（2）低速离心去碎片将平皿内的细胞悬液倒入试管中，离心1000r/s，4min，去上清液，加入0.5%胃蛋白酶（pH1.5～2.0）放入1mL，置37℃10min，中间振荡一次。（3）加入冷的PBS液8mL，终止消化，离心1000r/s，4min，去上清液，加入5mL PBS液。（4）显微镜检查:将制备好的单细胞悬液涂片，用10%的吖啶橙染色，在日本产的荧光显微镜下观察，并进行计算，确保细胞数为1×10 6 /mL，细胞分散良好，核结构保持完整，发出黄绿色或亮绿色银光，有的细胞核周围残留胞质，即可认为是可以作检验的单细胞悬液。
1.3.2 间接免疫荧光染色法 （1）将细胞悬液加入试管中，每管约1×10 6 /mL细胞离心，1000r/min，5min，弃上清液。（2）加入一抗（所标记的特异性抗体）100μL，室温下避光30min，加入二抗（FITC-IgG抗体）100μL，混匀。室温避光放置30min后加入PBS10mL，轻吹打，离心1000r/min，5min，弃上清液。（3）加入1mLPBS液用500目铜网过滤，样品放在0～4℃环境中，准备上机检测。
1.3.3 CyclinD1、CDK4表达的检测方法 采用美国BD公司生产的细胞仪FACS420型光源为2W氩离子激光器，工作功率为300mw，分别进行单参数检测，测量的数据、图形同时输入HP-300consort30计算机，应用相应的程序软件进行数据处理。测量前以鸡红细胞作为标准样品调整仪器的CV值在5.0%以内。
1.3.4 CyclinD1、CDK4表达的定量分析方法 参照Morkve等 ［2］ 提出的荧光指数（Fluorescence index，FI）代表每例标本的相对平均特异荧光强度，并以正常 胃粘膜细胞的FI值作为正常标准的阈值。F= 检测样品CyclinD1或CDK4平均荧光强度-对照样品平均荧光强度正常对照样品CyclinD1或CDK4平均荧光强度如FI值高于正常样品表达荧光强度的上限值，则判定阳性表达。
1.3.5 统计学处理 所有资料的统计处理采用χ 2 检验或四格表精确法。
2 结果
2.1 CyclinD1、CDK4表达特征 CylinD1、CDK4在胃癌中高表达，在癌旁组织中低表达（表1）
表1 胃癌，癌旁组织中CyclinD1、CDK4表达组织 略
2.2 CyclinD1、CDK4表达与胃癌分化程度和转移关系 高分化胃癌CyclinD1、CDK4阳性率明显低于未分化胃癌（表2）
表2 CylinD1、CDK4的表达与胃癌分化程度的关系病理类型 略
淋巴结未转移胃癌，CyclinD1阳性率明显低于淋巴结转移的胃癌（P<0.05）;而CDK4的表达在未转移癌和转移癌中差异无显著性（P>0.05），见表3。
表3 CyclinD1、CDK4的表达与胃癌转移的关系略
3 讨论
细胞周期失控是细胞异常增殖而导致癌变的重要原因，而细胞周期的不同时相由不同的细胞蛋白控制。CyclinD1、CDK4均为重要的细胞周期蛋白的调控基因，当任何原因导致这些基因异常表达时，将引起细胞周期调节失控，导致肿瘤的发生和恶性演进 ［3～4］ 。 CyclinD1定位时染色体11q 13 编码一个由295个氨基酸组成的蛋白产物，分子量为34KD，其在细胞中的功能是促进G1/S期的转变进而促进细胞周期，与细胞增殖有关。CyclinD1能刺激CDK4介导的Rb产物磷酸化，CyclinD1过表达将使CDK4对Rb调节失常，导致细胞失控性生长 ［5］ 。程剑 ［6］ 等研究发现，CyclinD1在胃癌中的过度表达，与胃癌的分化和转移相关，随分化的降低和转移的发生CyclinD1表达量上升，CyclinD1过表达在胃癌的发生及发展中起重要作用，检测CyclinD1基因变化，对判断胃癌的转移和恶性度以及评估预后有重要意义。本组实验结果显示，胃癌中CyclinD1阳性率56.3%（18/32）明显高于癌旁粘膜16.7%（4/24），二者差异存在显著性（P<0.01）。胃癌中，CyclinD1在高分化和未转移癌中的阳性率明显低于低、未分化和转移癌（P<0.05）。随着CyclinD1在癌旁粘膜及高、低、未分化腺癌表达量渐增，以及从未转移到转移癌表达量增加，表明高表达，肿瘤的恶性程度高，发生转移的机率大，提示CyclinD1在胃癌的发生、发展及癌变过程中起重要作用，对评估预后有重要意义。
CDK4是细胞周期重要的调节蛋白，它与CyˉclinD1形成复合物而活化，进而解除视网膜母细胞瘤基因蛋白（PRb）对细胞转录因子的抑制，促进细胞的增殖转化过程。本组实验提示CDK4在癌旁粘膜中低表达（20.8%），在胃癌组织中高表达（53.1%），二者差异存在显著性（P<0.01）。在胃癌组织中，随着分化程度降低，CDK4阳性表达渐增高，说明CDK4高表达，肿瘤的恶性程度增高，预后较差。而在未转移癌和转移癌中，CDK4表达无显著差异（P>0.05），这一结果与杨竹林等 ［7］ 研究的结果不一致，其原因可能与标本、试剂、阳性标准及例数有关。CDK4在胃癌中高表达，癌旁粘膜中低表达，提示其在胃癌的演变过程中起重要作用。
胃癌的发生发展是一个多步骤、多阶段演进的复杂过程，人们原来注重分析癌细胞本身特性，目前更注重对正常细胞演变为癌细胞过程的研究。癌基因CyclinD1和CDK4，其本身就是细胞调控机制的主要成分，它们的基因突变或缺失的结果，导致了细胞周期的失控，从而引发肿瘤。细胞周期失调与肿瘤 的关系作为一种学说有许多问题尚未阐明，需要进一步的研究来完善。预期从分子水平进行细胞周期基因表达和调控机制的研究，可望对胃癌的生物学行为有更深入的了解，提高判断预后的准确性，为临床治疗提供理论依据。
参考文献
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7 杨竹林，李永国，黄生福，等.胃癌组织中CyclinD1，CDK4，p16和Rb的表达及意义.世界华人消化杂志，2000，8（3）:362-363.
作者单位:010050呼和浩特内蒙古医学院第一附院普外科
（收稿日期:2004-07-16） （编辑江 风）