胃癌组织中VEGFC及其受体FLT4 mRNA的表达

【摘要】  目的 研究血管内皮生长因子C（VEGFC）及其受体VEGFR3（FLT4）mRNA在胃癌组织中的表达。方法 采用逆转录聚合酶链反应技术对34例胃癌和癌旁组织及16例正常胃黏膜组织中VEGFC及FLT4 mRNA的表达水平进行检测。结果 VEGFC与FLT4 mRNA在胃癌和癌旁组织中均有表达；VEGFC及FLT4 mRNA在胃癌、癌旁组织和正常胃黏膜组织中的表达有明显差异（χ2=23.87、18.97，P<0.05）；VEGFC及FLT4 mRNA在胃癌组织中的表达呈明显正相关（r=0.67，P<0.05）；VEGFC及FLT4 mRNA的表达与胃癌淋巴转移均呈明显正相关（r=0.52、0.52，P<0.05）；VEGFC mRNA在高、中和低分化胃癌组织中的表达有明显差异（F=21.04,P<0.05）；BorrmannⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型胃癌组织中VEGFC mRNA的表达有明显差异（F=57.94，P<0.05）。结论 VEGFC及其受体FLT4在胃癌的发生发展过程中可能起一定的作用；两者高表达可能与胃癌淋巴结的转移有关。

【关键词】  胃肿瘤 血管内皮生长因子C 基因表达

    EXPRESSION OF VEGFC AND ITS RECEPTOR FLT4 mRNA IN THE GASTRIC CARCINOMAMU LINSONG, SONG XIUQI, SUN SHAOJIE (Department of General Surgery, The Second Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266042, China)  ［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the expression of vascular endothelial growth factorC (VEGFC） and its receptor VEGFR3 (FLT4) at the mRNA level in gastric carcinoma.MethodsExpressions of VEGFC and FLT4 were studied by semiquantitative reverse transcriptasepolymerase chain reaction (RTPCR) among patients with gastric carcinoma (n=34) and adjacent normal tissues from the same patients.ResultsVEGFC and FLT4 were expressed in the tissue of the cancer and adjacent tissue. Significant differences in expressions of VEGFC and FLT4 were noticed among the cancer, adjacent  tissue and normal tissue samples (χ2=23.87，18.97;P<0.05）, and a positive correlation between VEGFC and FLT4 expression observed in the tissue of the cancer (r=0.67,P<0.05). With regard to VEGFC and FLT4 expression, there was a significant difference between positive and negative lymph node metastases (r=0.52;0.52,P<0.05).ConclusionVEGFC and its receptor FLT4 may play an important role in the development of gastric cancer, and the over expression of both of them are more likely involved in lymph node metastasis.

    ［KEY WORDS］stomach neoplasms; vascular endothelial growth factor C; gene expression

    恶性肿瘤具有侵袭性和转移性的特点，其转移程度的不同决定了病人的预后[1]。胃癌的发病率居所有恶性肿瘤第二位[2]，也是我国最常见的恶性肿瘤之一。胃癌的转移方式以淋巴转移为主，而淋巴转移的机制目前尚不很明确。血管内皮生长因子C（VEGFC）及其受体2（VEGFR2）在胃癌血行转移中的作用已经被证实[3]，但目前VEGFC和血管内皮生长因子受体 3（FLT4）在胃癌淋巴管形成、淋巴转移中作用尚未得到证实[3]。本研究试图应用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）技术，检测VEGFC及其受体FLT4在胃癌及癌旁组织中的表达，探讨VEGFC及其受体FLT4 mRNA在胃癌淋巴管形成及淋巴结转移中的作用。

    1  资料和方法

    1.1  一般资料

    2006年3月～2006年6月，青岛大学医学院附属医院普外科胃癌手术病例34例，其中男22例，女12例；年龄27～76岁，平均57岁。所有病例均经病理证实，且未行术前放、化疗。手术中尽快取新鲜癌组织及癌旁组织，立即放入-70 ℃冰箱中保存。34例胃癌组织中BorrmannⅠ型4例，Ⅱ型10例，Ⅲ 型14例，Ⅳ型6例。高分化10例，中分化7例，低分化17例。同期青岛大学医学院附属医院胃镜室行胃组织病理检查病人16例作为对照，其中男9例，女7例；年龄25～81岁，平均年龄51岁；所取新鲜标本经病理证实为正常胃黏膜组织，并经证实无其他影响VEGFC及FLT4表达的因素；将新鲜组织尽快放入-70 ℃冰箱中保存。

    1.2  主要试剂

    Trizol由INVITROGEN公司提供。RTPCR一步法试剂盒由QIAGEN公司提供。DNA Marker 由北京鼎国生物技术有限公司提供。

    1.3  VEGFC和FLT4 mRNA的检测

    1.3.1  总RNA提取  总RNA通过Trizol一步法提取，并溶解于焦碳酸二乙酯（DEPC）处理过的无RNA酶的水中，－70 ℃保存。RNA质量和纯度通过标准紫外分光光度计检测，A260/A280以1.75～1.95为宜。总RNA中以mRNA为主，mRNA作为RTPCR模板。

    1.3.2  引物设计  GAPDH引物：上游为5′ACTGCCACCCAGAAGACT3′，下游为5′GCTCAGTGTAGCCCAGGAT3′，长度为292 bp，退火温度为58 ℃。VEGFC引物：上游为5′TCAAGGACAGAAGAGACTATAAAATTTGC3′，下游为5′ACTCCAAACTCCTTCCCCACAT3′，长度为137 bp，退火温度为58 ℃。FLT4引物：上游为5′ACCGAGGTCATTGTGCATGAA3′，下游：5′CTCCACAAACTCGGTCCAGGT3′，长度为570 bp，退火温度为60 ℃。

    1.3.3  RTPCR  根据QIAGEN一步法使用说明书的要求，将超纯水10 μL、5×Buffer 10 μL、dNTPMix 2 μL、5×QSolution 10 μL、上游引物5 μL、下游引物5 μL、Enzyne Mix 2 μL、Template RNA 6 μL 配成总共50 μL体系，在PCR仪上进行反应。反应条件为：50 ℃预变性30 min，95 ℃逆转录15 min；然后94  ℃ 变性1 min， 58 ℃ 退火1 min，72 ℃延伸1 min，循环34次；最后72  ℃ 再延伸10 min。

    1.3.4  电泳  将PCR产物在含有溴化乙锭（EB）的25 g/L的琼脂糖凝胶中电泳，在凝胶成像仪上显色拍照并记录所得图像。对所得条带经Biocaptmw软件进行分析，然后将VEGFC和FLT4条带灰度值与对应的GAPDH灰度值进行比较并进行半定量分析。

    2  结    果

    2.1  VEGFC和FLT4的表达

    在34例胃癌及癌旁组织中，癌组织VEGFC阳性表达25例，FLT4阳性表达22例；癌旁组织VEGFC阳性表达7例，FLT4阳性表达6例； 16例正常胃组织中， VEGFC阳性表达3例，FLT4阳性表达3例。VEGFC 及FLT4 mRNA在胃癌、癌旁、正常组织中表达有明显差异（χ2=23.87、18.97，P<0.05）；两者在胃癌与癌旁及正常组织中表达有显著差异（χ2=9.19～19.13，P<0.05）；两者在癌旁及正常组织中的表达没有明显差异（P>0.05）。

    2.2  VEGFC和FLT4 mRNA表达的相关性

    在25例VEGFC表达阳性的胃癌组织中， FLT4阳性表达21例，而9例VEGFC表达阴性的胃癌组织中， FLT4阳性表达1例。VEGFC和FLT4在胃癌组织中的表达呈明显正相关（r=0.67，P<0.05）。

    2.3  VEGFC和FLT4与胃癌淋巴转移的相关性

    在有淋巴结转移的27例胃癌组织中，VEGFC mRNA表达阳性者23例，FLT4 mRNA表达阳性者23例；而7例无淋巴结转移胃癌组织中，VEGFC表达阳性2例，FLT4 mRNA表达阳性者2例。VEGFC及FLT4 mRNA的表达与胃癌淋巴转移均呈明显正相关（r=0.52、 0.52，P<0.05）。

    2.4  VEGFC在不同病理分型胃癌中表达的差异

    高、中、低分化胃癌组织中VEGFC mRNA表达水平分别为0.40±0.11、0.54±0.13、0.73±0.14。高、中、低分化组之间VEGFC mRNA表达水平差别有统计学意义（F=21.04,P<0.05）。低分化组VEGFC mRNA表达水平明显高于中、高分化组（q=4.60、9.01,P<0.05）；中分化组VEGFC mRNA表达水平高于高分化组（q=3.09,P<0.05）。

    2.5  VEGFC在不同Borrmann分型胃癌组织中的表达

    BorrmannⅠ、Ⅱ、 Ⅲ、Ⅳ型VEGFC mRNA的表达水平分别为0.16±0.07、0.29±0.11、0.71±0.11、0.81±0.12。4种分型之间VEGFC mRNA表达水平差别有显著意义（F=57.94，P<0.05）。Ⅰ型VEGFC mRNA表达水平明显低于Ⅲ、Ⅳ型（q=12.65、13.13，P<0.05）;而Ⅰ型与Ⅱ型VEGFC mRNA表达水平比较没有明显差异（q=2.87，P>0.05）；Ⅱ型VEGFC mRNA表达水平明显低于Ⅲ、Ⅳ型（q=13.23、13.13，P<0.05）；Ⅲ型和Ⅳ型VEGFC mRNA基因表达水平没有明显差异（q=2.67，P>0.05）。

    3  讨    论

    3.1  VEGFC与FLT4的分子生物学特征

    VEGFC是VEGF家族成员之一，在多数肿瘤细胞中有表达，VEGFC基因位于人染色体4q34上[4]，编码一种含有419个氨基酸残基的蛋白质。VEGFC的前蛋白包括一个N端信号肽，其后为VEGF同源区和一个C端前肽， VEGFC前蛋白经蛋白酶水解后产生截短的成熟形式,从而发挥促淋巴管生成的作用。

    VEGFC主要受体包括VEGFR2（KDR）和FLT4两种，VEGFR2主要分布在血管内皮上，在调节血管生成中起作用。在成人，FLT4主要分布于淋巴管，正常组织的血管通常没有FLT4的表达，FLT4既能介导淋巴管生成，又可以作为成熟淋巴管的内皮细胞的特异性标记物[5]。淋巴管生成遵循典型的Ras传导有丝分裂原激活的蛋白激酶（Ras/MAPK）途径，当VEGFC与FLT4结合后，诱导淋巴管内皮细胞有丝分裂，产生细胞增殖效应，并促进内皮细胞的迁移及淋巴管的形成[6]。在VEGFC低浓度时，更容易与FLT4结合诱导淋巴管的增生[7]，增生的淋巴管内皮细胞简单，细胞之间连接不紧密、不完整以及基膜缺失，比血管更容易渗透，所以容易发生肿瘤的转移。然而，到目前为止，肿瘤新生淋巴管的形成及淋巴转移与VEGFC及FLT4的关系尚未得到证实。

    3.2  VEGFC及FLT4 mRNA在胃癌淋巴转移中的作用

    本研究运用半定量RTPCR技术对34例原发性胃癌及其癌旁组织及16例正常胃组织中VEGFC和FLT4 mRNA的表达进行研究。结果表明，胃癌组织中VEGFC和FLT4 mRNA的表达呈明显正相关。YONEMURA等[8]用免疫组织化学技术方法对85例原发性胃癌VEGFC和FLT4的相关性进行研究，结果提示，VEGFC在胃癌组织中的表达率为55%，在正常胃黏膜为13%，55%的胃癌组织表达FLT4 mRNA，VEGFC与FLT4表达呈正相关。本研究同时表明，VEGFC mRNA在癌组织中的表达明显高于癌旁组织；低分化型胃癌组织中VEGFC mRNA的表达明显高于高分化型；有淋巴结转移的胃癌组织VEGFC和FLT4 mRNA表达明显高于无转移者；BorrmannⅢ、Ⅳ型癌组织VEGFC mRNA的表达明显高于Ⅰ、Ⅱ型。LIU等[6]研究也显示，在人类肿瘤组织中可见肿瘤周边新生淋巴管、扩张的淋巴管、有癌栓的淋巴管和有肿瘤转移淋巴结内，淋巴管的内皮细胞FLT4均呈高表达。KABASHIMA等[9]通过对35例有淋巴结转移及70例无淋巴结转移的原发性胃癌的研究来分析VEGFC的表达与淋巴转移的关系，结果显示，VEGFC在淋巴结阳性的胃癌组织中的表达明显高于淋巴结阴性组。LIU等[6]的研究也分别证实，VEGFC在胃癌、卵巢癌、结直肠癌及前列腺癌组织中的表达与淋巴结转移密切相关，可以将其作为淋巴转移的生物标记物；确认了VEGFC可作为肿瘤淋巴管生成的一种潜在增强因子，从而促进肿瘤细胞经淋巴管的转移性播散。

【参考文献】
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[5]KAIPAINEN A, KORHONEN J, MUSTONEN T, et al. Expression of the fmslike tyrosine kinase 4 gene becomes restricted to lymphatic endothelium during development [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1995,92(8):35663570.

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[7]孙迪文,项锋钢. 肺癌VEGF和MMP2的表达与临床病理特征的关系[J]. 青岛大学医学院学报， 2004,40(1):4446.

[8]YONEMURA Y, FUSHIDA S, BANDO E, et al. Lymphangiogenesis and the vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR)3 in gastric cancer[J]. Eur J Cancer, 2001,37(7):918923.

[9]KABASHIMA A, MAEHARA Y, KAKEJI Y, et al. Overexpression of vascular endothelial growth factor C is related to lymphogenous metastasis in early gastric carcinoma[J]. Oncology, 2001,60(2):146150.

作者单位：青岛大学医学院第二附属医院普外科，山东 青岛 266042