瘦素在原发性肝癌组织表达及血管生成中的作用

【摘要】  目的 探讨瘦素(Leptin)在原发性肝癌组织表达及血管生成中的作用。方法 应用免疫组化法检测76例肝癌组织及53例癌旁组织制成的组织芯片中Leptin、肿瘤内微血管密度(MVD)、CD105、细胞核增殖抗原Ki67的表达及其相关关系。 结果 肝癌组织细胞中Leptin的表达低于癌旁组织，Leptin表达与肝癌的分化程度无明显相关关系(r=0.380，P>0.05)，与MVD、CD105、Ki67呈负相关关系(r=-0.323、-0.309、-0.309，P<0.05)。结论 Leptin可能抑制肝癌的血管生成及肝癌细胞的增殖。

【关键词】  肝癌 组织芯片 瘦素 微血管密度

    EXPRESSION OF LEPTIN AND ITS ROLE IN ANGIOGENESIS IN PRIMARY HEPATOMALI YING, YU JIANXIAN, HUANG WEIQING, et al (Department of Pathology, Qingdao Municipal Hospital, Qingdao 266011, China) ［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the expression of leptin and  its  role in angiogenesis in  primary liver cancer. MethodsThe  expression of leptin, MVD, CD105 and Ki67 were examined immunohistochemically and tissue microarray technique in 76 hepatoma tissue samples and 53 paraneoplastic tissue samples. ResultsThe expression of leptin in hepatoma tissue was lower than that in paraneoplastic and was not significantly correlated with the differentiation of the cancer (r=0.380). Leptin was negatively correlated with MVD (r=-0.323), CD105 (r=-0.309) and Ki67 (r=-0.282). ConclusionThe results suggest that leptin may inhibit angiogenesis and proliferation of hepatoma.

    ［KEY WORDS］hepatoma; tissue microarray; leptin; microvessel density

    瘦素（Leptin）是人和动物肥胖基因的一种激素类产物,主要由脂肪细胞分泌，棕色脂肪组织、胎盘、肌肉和胃黏膜也合成少量Leptin，通过对食物摄入和能量代谢的调节来维持体质量的平衡。此外,Leptin也参与其他一些生理过程的调节, 如脂质代谢、造血、胰岛B细胞的功能、卵巢功能以及免疫功能等方面的调节。近年的研究发现，Leptin在肿瘤细胞中也有表达，而且与肿瘤的发生发展关系密切[1,2]。本研究采用组织芯片技术检测Leptin在76例原发性肝癌及53例癌旁组织中的表达,探讨其在肝癌血管生成中的作用。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    选取2001年3月～2005年3月青岛市市立医院、青岛大学医学院附属医院外科手术切除、经病理证实为原发性肝癌标本76例，男64例，女12例，中位年龄51岁（0～79岁）。其中41例并发脂肪肝,39例感染HBV，32例并发肝硬化，13例可见到肝细胞灶性坏死，6例仅有肝功能异常；取53例同体癌旁组织作为对照。复习全部病例的临床资料，对所有标本进行细胞学分型和组织学分型[3]，其中高分化癌20例，中分化癌34例，低分化癌22例（其中包括10例透明细胞癌）。

    1.2  方法

    新鲜标本经40 g/L中性甲醛溶液固定，24 h内取材，常规石蜡包埋，应用组织芯片制作仪（Tissue  Arrayer）制备48（6×8）点阵列的肝癌组织及对照癌旁组织芯片蜡块3个，即由76例原发性肝癌标本及53例癌旁组织组成的组织芯片一套，4 μm连续切片，分别行苏木精伊红染色和免疫组织化学染色。显微镜下观察结果。

    免疫组织化学染色用PV 9000通用型二步法检测系统，Leptin多克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司（工作浓度1∶600），CD105(工作浓度为1∶50)、CD34、Ki67（工作浓度1∶100，1∶50）和免疫组化试剂盒均购自美国Maixim公司，蛋白酶ⅩⅩⅤ购自美国LAB公司。操作按说明书进行，用已知阳性片作阳性对照，用同种动物非免疫血清替代一抗作阴性对照。阳性对照片与阴性对照抗体均购自美国Maixim公司。

    1.3  结果判断

    1.3.1  Leptin阳性判断标准  阳性染色细胞的胞质为棕黄色。根据细胞质的染色程度及染色细胞百分率进行评分：基本不着色者为0分，着色淡者为1分，着色适中者为2分，着色深者为3分；着色细胞占计数细胞百分率≤5％为0分，6％～25％为1分，26％～50％为2分，>50％为3分。将每张切片着色程度得分与着色细胞百分率得分乘积作为其最后得分。0～1分为阴性（－），2～3分为弱阳性（＋），4～6分为中等阳性（），6分以上为强阳性（）［4］。

    1.3.2  细胞增殖核抗原Ki67阳性判断标准  Ki67阳性细胞为细胞核出现棕褐色颗粒。以Ki67标记指数（LI）表示,即计数随机10个高倍镜视野中（400倍）1 000个细胞中Ki67阳性细胞的个数［4］。

    1.3.3  CD34、CD105 阳性判断标准  CD105 和CD34 阳性均为血管内皮细胞胞浆呈棕黄色，以CD34阳性表达代表MVD。 微血管计数以双盲法进行。任何染色为棕黄色的内皮细胞或内皮细胞簇都记为一条独立的血管，这些血管之间必须要有清楚的分离[5]，在100倍物镜下挑选微血管分布最高的区域，然后在200倍显微镜下（每视野0.785 mm2）计数5个视野被染成棕黄色的血管数目，取其平均值作为微血管密度（MVD）。分辨不清或染色模糊的细胞不计入结果。

    1.4  统计学处理 

    采用SPSS 11.5统计软件包进行相关分析、t检验及秩和检验。

    2  结    果

    2.1  Leptin表达的一般情况

    Leptin阳性染色呈异质性，在肝癌组织中表达强阳性12例（15.79％），中等阳性10例（13.16％），弱阳性46例（60.53％）。在53例癌旁组织中46例表达为中等阳性或强阳性（86.79％），弱阳性7例。Leptin的表达在肝癌组织中与在癌旁组织中差异有显著性（u=6.0,P<0.05）。

    2.2  Leptin表达与肝癌分化程度的关系

    Leptin表达与癌细胞分化程度无相关关系（r=0.380,P>0.05）。

    2.3  Leptin 表达与MVD及CD105的关系

    肝癌组织Leptin的表达与MVD呈显著负相关关系（r=-0.323,P<0.05）。CD105表达明显低于MVD，两者之间差异有显著性（t=3.746,P<0.05）,Leptin表达与CD105之间呈负相关关系（r=-0.309,P<0.05）。

    2.4  Leptin表达与Ki67的关系

    肝癌细胞Leptin的表达与Ki67的表达呈负相关关系（r=-0.282,P<0.05）。见表1。表1  Leptin表达与MVD、CD105及Ki67的关系

    3  讨    论

    Leptin生物学功能是多方面的、复杂的，以往对 Leptin的研究主要集中于其对能量代谢和脂肪沉积的调节作用, 即对体脂及体质量的调控, 它主要通过胰岛素瘦素神经肽Y(NYP) 反馈系统实现。Leptin作用于下丘脑ARC 神经元表面细胞的受体, 抑制下丘脑NPY基因的表达分泌, 从而抑制动物的摄食量, 增加消耗，减少脂肪沉积, 当这一机制被破坏, 即可导致肥胖的发生［6］。

    Leptin与许多疾病有关。黄学元等［7］报道，乳癌细胞及原发性肿瘤中均有Leptin的表达。体外实验发现，给予一定剂量的外源性Leptin可诱导人结肠癌细胞株HT229,食管癌细胞株KYSE410 和KYSE150,乳癌细胞株AR7521、T472D 和MCF27,前列腺癌细胞株DU145、DC23,卵巢癌细胞株IOSE280PC、BG21、OVCAR23和SKOV23 的生长和增殖；给予外源性Leptin可促进人结肠癌细胞株Lovo 和前列腺癌细胞株DU145 及PC23 的侵袭和迁移，抑制顺铂诱导人白血病细胞株K562 的生长停滞和DNA 损伤；给予Leptin受体中和抗体可明显抑制骨髓移植白血病细胞小鼠模型骨髓部分的血管密度［8，9］。而Leptin在肝癌中表达研究较少。

    本文结果显示，在人原发性肝癌细胞和血管内皮细胞上均有Leptin的表达, 且与MVD 密切相关,邻近的癌旁组织细胞表达的Leptin水平高于肝癌细胞，10.52%的肝癌细胞缺乏Leptin的表达，且60.53%的肝癌呈弱阳性低表达，提示Leptin在肝癌的起始和发展过程中可能起一定的作用。本实验结果还显示，Leptin的表达与肝癌的分化程度之间并无相关性，癌旁组织Leptin中等阳性和强阳性表达率明显高于肝癌组织，而且肝癌组织与癌旁组织的Leptin表达差异有显著性，提示Leptin可能抑制肝癌的起始生成。

    癌症在发生发展中需要大量的血供，血管生成是恶性实体肿瘤突破上皮基膜后进一步生长所必需的［10］,恶性实体肿瘤中新生血管的定量被认为是重要的独立的预后标志［11］。CD34标记的是早已存在的血管，而CD105是肿瘤新生血管研究的理想标记物[10]。本实验结果显示，肝癌组织Leptin表达与MVD、CD105呈负相关关系，说明Leptin对血管生成有一定的抑制作用；而MVD、CD105与肿瘤的侵袭程度密切相关［9］，提示Leptin可能在肿瘤的侵袭性方面起一定的作用，其确切机制还有待进一步的研究证实。

    有研究表明，Leptin对人类的癌细胞增殖表现出不同的作用：它既可增强乳癌、食管癌、前列腺癌细胞的生长潜力，又能抑制胰腺癌细胞的生长［8］。Ki67 是一个可靠而迅速反映恶性肿瘤增殖率的指标, 已被广泛应用于肿瘤的增殖细胞动力学研究,其高表达是细胞增殖活跃的重要标志, 对肿瘤的转移及预后有影响。LIU等［12］和MULLERAT 等［13］认为，Ki67 与多种肿瘤的侵袭能力有关,随着肿瘤侵袭性的增强, Ki67 的表达相应增强,它可以作为衡量肿瘤侵袭能力大小的标志。本文中Ki67与肝癌Leptin表达呈负相关关系，说明Leptin对肝癌细胞增殖有一定的抑制作用，其机制还有待进一步的研究。

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［12］LIU M, LAWSON G, DELOS M, et al. Prognostic value of cell proliferation markers, tumour suppressor proteins and cell adhesion molecules in primary squamous cell carcinoma of the larynx and hypopharynx［J］. Eur Arch Otorhinolaryngol, 2003,260:2834.

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作者单位：青岛市市立医院病理科,山东 青岛 266011