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【摘要】 目的 探讨非小细胞肺癌(NSCLC) 术后外周血微转移的基因诊断方法,并分析黏蛋白1 (MUC1) mRNA、角蛋白19 (CK19) mRNA 作为肺癌微转移检测分子标志物的可行性。方法 应用逆转录聚合酶链反应(RTPCR),对60例NSCLC病人(肺癌组)的外周血MUC1 mRNA、CK19 mRNA 表达情况进行检测;以10 例肺良性病变病人及15例健康人的外周血标本作对照。结果 肺癌组外周血MUC1 mRNA阳性表达21例(35%),CK19 mRNA阳性表达18例(30%);对照组MUC1 mRNA和CK19 mRNA 表达均为阴性,两组比较差异均有显著性(χ2=7.292、5.921,P<0.01、0.05)。结论 MUC1、CK19 基因均可作为RTPCR 法检测NSCLC 病人淋巴结微转移的分子标志物,两者联合检测可能有助于肺癌转移早期诊断。
【关键词】 癌, 非小细胞肺;黏蛋白质类;角蛋白
THE SIGNIFICANCE OF EXPRESSION OF MUC1 mRNA AND CK19 mRNA IN PERIPHERAL BLOOD IN PATIENTS WITH NONSMALL CELL LUNG CANCER AFTER SURGERY
LI SHUYONG, AN YONGHENG
(Department of Oncology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China);
[ABSTRACT] Objective To investigate gene diagnosis of micrometastasis in peripheral blood in patients with nonsmall cell lung cancer (NSCLC) and the feasibility of mucin 1 (MUC1) mRNA and cytokeratin 19 (CK19) mRNA as molecular marker to detect micrometastasis of lung cancer. Methods Expression of MUC1 mRNA and CK19 mRNA was detected by reverse transcriptasepolymerase chain reaction (RTPCR) in peripheral blood taken from 60 patients with NSCLC,10 with pulmonary benign diseases and 15 healthy volunteers. Results Of the 60 cancer patients, MUC1 mRNA expression was detected in 21 (35%) and CK19 mRNA in 18 (30%). Neither MUC1 mRNA nor CK19 mRNA expression was observed in all the blood samples of the benign pulmonarylesion group and healthy volunteers. Conclusion The detection of both MUC1 mRNA and CK19 mRNA by RTPCR might be used as a molecule marker in the diagnosis of micrometastasis of NSCLC, which is conducive to an early diagnosis of lung cancer metastasis.
[KEY WORDS] Carcinoma, nonsmall cell lung; Mucoproteins; Keratin
近年来,肺癌的发病率不断上升,其病死率已占恶性肿瘤的首位。外科手术仍然是目前治疗非小细胞肺癌(NSCLC) 最主要的方法,但与其他癌种相比,治疗效果不佳。肺癌外科手术后,影响生存的最主要因素不是局部复发,而是远处转移。肺癌是全身性疾病,即使是Ⅰ期肺癌仍存在微转移灶的可能,手术时因挤压出血可促使癌细胞在局部种植或经血循环、淋巴循环转移;而手术后病人抵抗力下降,又可促进癌细胞的转移[1]。这预示着手术时切除范围以外的淋巴结、远隔脏器、血液中已经有隐匿或微量癌转移细胞的存在。由于尚未形成肿瘤转移结节,且无任何临床表现,常规检查方法如影像学、常规病理学检查等难以发现。逆转录聚合酶链反应(RTPCR)技术已被用于检测实体瘤微转移细胞中特异mRNA的表达,具有很高的灵敏度,每105~107个正常有核细胞中含1~10 个癌细胞即可检测出[2]。本研究应用RTPCR技术检测NSCLC术后病人外周血黏蛋白1 (MUC1)、角蛋白19 (CK19)基因表达,探讨其对NSCLC微转移的诊断价值。
1 材料与方法
1.1 标本来源
NSCLC病人术后外周血标本60例,取自我院肿瘤科2006年11月~2007年6月首次接受化疗的部分病人,其中男38例,女22例;平均年龄59.7岁。所有病例均经病理学检查确诊。以10 例肺良性病变病人(均排除并发有其他部位肿瘤,男6例,女4例,平均年龄58.2岁)及15例健康人(均为医学研究生和本科生)的外周血标本作对照。
1.2 主要试剂
焦碳酸二乙酯、氯仿、异丙醇、淋巴细胞分离液购自天津市灏洋生物制品科技有限公司,Trizol试剂购自美国Invitrogen公司,逆转录PCR试剂盒购自日本TAKARA公司。
1.3 引物的设计与合成
引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列见表1。
表1 MUC1、CK19及βactin 基因引物序列(略)
1.4 标本收集及总RNA提取
抽取新鲜EDTA抗凝血3 mL(为防止上皮细胞污染,应先弃去开始的2 mL血液),加淋巴细胞分离液分离单个核细胞,按说明书进行总RNA的提取,然后置-80 ℃冰箱保存。总RNA均经紫外线分光仪测定,A260/A280在1.80左右。
1.5 RTPCR
逆转录及PCR反应均按照TAKARA试剂说明书进行。PCR条件:94 ℃预变性2 min;94 ℃变性45 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,循环扩增36次;72 ℃终延伸7 min。
1.6 统计学处理
采用χ2检验, 用SPSS 12.0 软件包处理。
2 结果
2.1 肺癌组与对照组外周血MUC1 mRNA和CK19 mRNA的表达
肺癌组外周血标本MUC1 mRNA阳性表达率为35%(21/60),CK19 mRNA阳性表达率为30%(18/60);对照组外周血标本二者表达均为阴性,两组比较差异均有显著意义(χ2=7.292、5.921,P<0.01、0.05)。见图1、2。
2.2 外周血MUC1 mRNA、CK19 mRNA表达与肺癌临床病理特征的关系
外周血MUC1 mRNA和CK19 mRNA表达与病人年龄、性别、是否吸烟、原发肿瘤大小、肿瘤部位等均无明显关系(P>0.05),而与肺癌组织学类型、细胞分化程度、PTNM 分期等均有密切关系(χ2=6.747~10.326,P<0.01)。见表2。
图1 部分肺癌病人CK19 mRNA的RTPCR结果(略)
460 bp条带为CK19 mRNA,154 bp条带为βactin,①~④代表不同样品的RTPCR产物
图2 部分肺癌病人MUC1 mRNA的RTPCR结果(略)
280 bp条带为MUC1 mRNA,154 bp条带为βactin,①~④代表不同样品的RTPCR产物
3 讨论
在肺癌微转移的检测中,目前尚缺乏公认的分子标志物。单独检测某一肿瘤标志物基因存在两个问题,一是阳性率不高,二是特异性不强,因此我们采用了RTPCR方法联合检测MUC1 mRNA和CK19 mRNA。MUC1基因是一种上皮组织特异性标志物,编码上皮组织细胞膜上黏蛋白的核心蛋白,在正常外周血、骨髓及淋巴结中不表达,是用于检测微转移的可靠分子标志物。周清华等[3]应用RTPCR技术检测MUC1 mRNA在肺癌病人外周血和骨髓表达的灵敏度为10-6。CK起源于上皮细胞,是上皮细胞和上皮来源的恶性肿瘤细胞中间丝的组成成分,是上皮分化的最可靠指标,对上皮组织的定性具有独特价值。其中CK19在血液、骨髓、淋巴结等间叶组织中不表达, 而在乳癌、胃肠癌、肺癌等上皮性肿瘤组织中稳定表达,也是检测循环癌细胞的敏感标志物。HSP70的诱导不仅与缺血耐受在时间上相一致,还与缺血耐受间存在量效关系,即HSP70表达多者保护效果好。本实验中,预处理组大鼠海马HSP70较未预处理组明显深染。最耐受缺血的海马CA3区细胞与齿状回颗粒细胞中HSP70表达最多,缺血后死亡的海马CA1区神经元中HSP70表达最少。若6 min缺血前未予预处理,不管在缺血后2 d还是7 d,CA1区神经元均无HSP70表达,是神经元应激及代谢不能恢复的结果。CA1区细胞虽然在缺血2~3 d后才出现神经元的坏死,但它们的命运也许在早期即已决定(细胞凋亡)。提示若在缺血初期给予相应的治疗,加速HSP70基因转录水平的表达,缓和HSP70 mRNA从翻译到蛋白质合成阶段失调,就有可能逆转细胞凋亡的过程。实验结果证实,在脑室注射HSP70抗体或HSP合成抑制剂可以阻止缺血耐受现象的发生,也从侧面证实HSP70的诱导和表达对缺血后的脑组织具有保护作用。
现在认为HSP70的保护作用的机制可能有3点:①通过影响多肽的折叠、展开转位以及蛋白复合物的聚合或降解发挥作用。HSP可维持部分变性蛋白的空间结构,促进大蛋白及多肽穿透线粒体膜和内质网的运动。应激状态下,HSP合成后,结合至细胞内变性蛋白上,防止进一步变性,并促进其正常折叠装配,恢复其三级结构。②在应激条件下,HSP70可抑制氧阴离子的产生并激化过氧化氢酶而发挥其抗氧化作用,使细胞内源性抗氧化能力增强。③HSP在体外实验中被证实可保护神经元免受兴奋性氨基酸如谷氨酸的毒性作用。
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作者单位:青岛大学医学院附属医院肿瘤科,山东 青岛 266003