感染中枢神经系统肠道病毒的分子生物学分型

【摘要】  探讨小儿肠道病毒（EV）中枢神经系统感染病毒基因VP1序列的分子分型的临床意义。方法采用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)方法，应用通用引物和VP1段分子分型引物检测77例临床诊断为无菌性脑膜炎病儿（其中急性期63例，恢复期14例）脑脊液(CSF)的EV RNA，并对VP1分型引物扩增阳性片段进行克隆、测序及分型研究。结果 77例无菌性脑膜炎病儿CSF中，采用通用引物经两次PCR在急性期共获得阳性结果47例（占急性期的74.6％），恢复期3例(占恢复期的21.4%)。将EV RNA 阳性的 50例标本应用分型引物经两次PCR共获得阳性结果31例（占62.0%）。随机抽取27条阳性片段进行克隆测序，测序结果通过BLAST软件与GenBank EV标准毒株进行同源性对比分析，相关序列同源性均在97％以上。结论 采用分型引物扩增VP1部分序列并测序，将EV的VP1部分序列与GenBank中的EV标准毒株进行对比，根据基因序列的同源性可以对EV进行型别鉴定，为EV的分型研究提供了新的方法和思路。

【关键词】  肠道病毒感染;逆转录聚合酶链反应 VP1核酸序列

 
　　MOLECULAR TYPING OF ENTEROVIRUSES OBTAINED FROM CEREBROSPINAL FLUID OF CHILDREN WITH CENTRAL NERVOUS SYSTEM INFECTION

　　LI  PENG, GUO  HUA, CHEN  ZONGBO
　　(Department of Pediatrics, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China)

　　［ABSTRACT］ObjectiveTo explore the clinical significance of typing enterovirus involved in central nervous system (CNS) infection in children.MethodsBy using reverse transcription polymerase chain reaction (RTPCR) and consensus primer and typing primer, the enterovirus RNA from cerebrospinal fluid (CSF) of 77 (63 acute and 14 convalescence) children with enteroviral CNS infection were detected. The nucleotide sequence of positive specimen was analyzed using VP1 typing primer.ResultsOf the 77 CSF specimens undergoing RTPCR with consensus primer amplification, 47 out of 63 acute cases (74.6%) were positive, three out of 14 at convalescence stage (21.4%) were positive. These 50 positive specimens were further analyzed with typing primer amplification, 31 (62.0%) showed positivity. The sequence of 27 randomly selected segments showed 97% nucleotide homology compared with GenBank EV.ConclusionRTPCR amplification with typing primer and sequence analysis provides a new approach to EV typing.

    ［KEY WORDS］Enterovirus infections; Reverse transcriptase polymerase chain reaction; VP1 nucleotide sequencing; Genes, viral

    肠道病毒（EV）有近70个血清型,其中包括脊髓灰质炎病毒(PVs)、柯萨奇病毒(CVs)、埃可病毒(Echos)和新发现的EV，是引起小儿中枢神经系统感染的主要病原[1～6]。目前,国外报道多采用PCR技术诊断EV感染，但长期以来，EV病原诊断及分型困难[7,8]，并且对EV临床分离毒株的基因结构及型别鉴定缺乏研究。本文采用分子生物学方法及基因测序对无菌性脑膜炎和脑炎病儿的脑脊液(CSF)标本进行研究，现将结果报告如下。

　　1  资料和方法

　　1.1  标本及其来源

    2005年1月～2006年2月，收集青岛大学医学院附属医院和滨州医学院附属医院临床诊断为无菌性脑膜炎、脑炎[9]病儿77例的CSF标本，急性期63例，恢复期14例,男41例，女22例，年龄11 d～12岁，平均6.7岁。入院当天及恢复期(症状体征消失)分别收集1.0 mL CSF。所有CSF均做细菌培养及常规检查。以COXB3、ECHO30和EV71标准病毒株（中国科学院昆明生物学研究所提供）为阳性对照。以13例脑外手术病儿（男7例，女6例；年龄5个月～12岁，平均6.2岁）作为阴性对照。

　　1.2  方法

　　1.2.1  引物的设计与合成

　　①通用引物：在EV基因组5′端的非编码区设计一对通用引物[10],引物1：5′TCCGGCCCCTGAATGCGGCTAAT3′,引物2： 5′CACYGGATGGCCAATCCA3′,上游引物为完全保守的核苷酸序列,下游引物5′端第4个核苷酸一部分为T,另一部分为C。扩增产物为194 bp的片段。②分型引物：通过查阅相关文献[7,8,11]，选用两对简并引物(02：5′ATGTAYGTICCICCI GGIGG3′，03：5′ATGTAYRTICCIMCIGGIGC3′，01：5′GCICCIGAYTGITGICCRAA3′)，扩增片段大小为450 bp,含VP1区3′段及2A区5′末端的基因片段。以上所有引物均由上海生物公司自动合成仪合成。

　　1.2.2  EV RNA的提取和RTPCR 

　　采用改良的酸性胍酚氯仿一步法(AGPC)[12]提取EV RNA。逆转录合成cDNA及PCR扩增按常规进行[3,4]。

　　1.2.3  EV VP1区序列分析 

　　应用EV分型引物对VP1段进行RTPCR后，产物经上海博亚生物技术有限公司琼脂糖凝胶回收系统回收纯化。由于简并引物产物不能直接进行测序，先将产物构建载体连接入质粒后转染大肠杆菌，然后进行克隆测序，测序引物为M13R(48)，使用ABI 3730型DNA序列自动分析仪分析。

　　1.2.4  VP1基因变异及同源性分析 

　　序列结果通过NCBI网站上的BLAST程序与GenBank EV标准毒株进行同源性对比分析。

　　1.2.5  统计学分析 

　　数据用SPSS 12.0软件进行处理，数据间比较采用χ2检验。

　　2  结 果

　　2.1  RTPCR检测

　　2.1.1  通用引物 

　　3株阳性标准毒株（COXB3、ECHO30、EV71）经RTPCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，产物均显示一条长度约为194 bp的单克隆带，条带清晰、无非特异性扩增；所有对照标本均不能被扩增检测。本文77例无菌性脑膜炎、脑炎CSF标本一次PCR在急性期获得阳性结果43例（占急性期68.2％），恢复期阳性3例。利用通用引物对剩余阴性标本进行二次PCR再检出阳性结果4例。两次PCR在急性期共获得阳性结果47例（占急性期的74.6％），恢复期3例。一次和两次PCR检测无菌性脑膜炎、脑炎病儿急性期CSF中EV RNA的阳性率差异无显著性（P>0.05）。

　　2.1.2  分型引物 

　　将应用通用引物两次PCR筛选得到的50例EV阳性的CSF标本利用分型引物进行扩增，一次PCR扩增检测得到阳性的13例，二次PCR又检出阳性结果18例,两次PCR共获得阳性结果31例（占62.0%），一次PCR和两次PCR阳性率比较，差异有显著性（χ2=13.149,P<0.01）。

　　2.2  EV临床毒株的型别

    从应用分型引物经两次PCR获得的阳性结果31例中，随机选出27例送生物公司进行测序，测序结果应用BLAST软件与GenBank EV标准毒株进行同源性对比分析，相关序列同源性均在97％以上。见表1。表1  27例EV临床毒株与GenBank EV标准毒株同源性对比分析结果（略）

　　3  讨论

    EV是世界范围内引起病毒性中枢神经系统感染最常见的病原体，但长期以来病原诊断困难。对EV进行诊断与定型的传统方法,即所谓金标准方法是用敏感的细胞培养病毒,然后用EV组合血清进行型别鉴定。该法不仅耗时长、繁琐,而且还常常出现无法定型的分离株，敏感性低、特异性差，其检查结果不能及时指导急性期疾病的临床诊治。陈宗波等[3,4,12]建立的RTPCR方法在临床检测EV病原体方面具有高度的敏感性和特异性,操作相对简单、省时、省力。该方法的建立对于快速明确病原，指导临床治疗意义重大。

    本文利用EV 5′非编码区（5′UTR）高度保守区在EV病毒属中的特异性设计通用引物，对3株阳性标准毒株，77例无菌性脑膜炎、脑炎临床标本及阴性对照组进行扩增检测，结果表明，3株阳性标准毒株（COXB3、ECHO30、EV71）经RTPCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，产物均显示一条长度约为194 bp的单克隆带，条带清晰、无非特异性扩增；所有对照标本均不能被扩增检测。说明以通用引物进行RTPCR检测特异性强，可靠性高，实用性好。在63例临床诊断为无菌性脑膜炎、脑炎急性期病儿CSF标本中，47例检测到清晰的单克隆条带，占总例数的74.6％，与国内外相关研究结果基本一致。
    EV是中枢神经系统感染的常见病原体，血清型多，常见的有柯萨奇A 7、9、11型病毒，柯萨奇B1～5型病毒， 埃可4、6、12、30及EV71等70余种，均在RTPCR方法检测范围内[11]。但对EV进行型别鉴定国内文献报道很少。BOURLET等[8]应用 VP1的3′端设计的简并引物成功地扩增出了其中的51个血清型的标准毒株，其引物设计考虑到了VP1氨基酸序列的变异和密码子的简并性，四重密码子简并处设计为脱氧次黄嘌呤核苷。本文先应用通用引物筛选，后应用根据EV VP1段设计的两对引物011、012、041对标准毒株和临床样本进行扩增检测，结果表明，标准毒株COXB3和 ECHO30 RTPCR产物均显示一条长度约为450 bp的单克隆带，条带清晰、无非特异性扩增。对通用引物筛选出的50例EV阳性的CSF标本用分型引物进行扩增检测，其中31例结果阳性，占62.0%。扩增产物经纯化并克隆测序，序列结果输入GenBank进行相关序列的比较分析，结果显示，随机抽取的27例临床标本全部被成功地测序并分型。这也同时证明了通用引物与分型引物检测的可行性与特异性。说明在对EV临床感染的型别检测中，应用分型引物结合GenBank EV标准毒株序列对比，可以克服传统血清学分型方法的缺点，更准确地了解小儿EV感染的病毒型别特点，从而为深入研究该病毒，了解其导致小儿中枢感染的发病机制提供新的思路，并且可为进一步治疗提供可行性指导建议。

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作者单位：青岛大学医学院附属医院儿科,山东 青岛 266003;