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【摘要】 目的 观察血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)贝那普利和血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ) 1 型受体拮抗剂厄贝沙坦对2型糖尿病大鼠早期动脉粥样硬化形成的影响,并探讨其可能的机制。方法 40只雄性SD大鼠随机分为正常对照组（A组）、 2型糖尿病组（B组）、贝那普利组（C组）和厄贝沙坦组（D组），每组10只。以高糖高脂饮食方法建立SD大鼠糖尿病模型, 16 周后测定总胆固醇(TC)、三酰甘油 (TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL2C)水平与稳态血糖（BG）、稳态胰岛素（PGI）浓度;采用免疫组化法检测主动脉血管壁核转录因子(NF2κB) 及细胞间黏附分子21 (ICAM21) 表达水平。结果 B、C、D组TC、TG、LDL2C与BG水平较A组显著升高(F=6.18～182.56，q=3.49～28.36，P<0.01)，但B、C、D组TC、TG、LDL2C与BG水平差异无显著意义(P>0.05)。C、D组主动脉血管壁NF2κB 及ICAM21 表达水平和浸润的单核细胞数明显少于B组(F=37.64～217.33，q=6.01～22.41，P<0.01),主动脉内皮损伤程度明显轻于B组。结论 贝那普利和厄贝沙坦能抑制2型糖尿病大鼠血管壁NF2κB 活化、ICAM21表达和单核细胞浸润,可防止早期动脉粥样硬化形成。
【关键词】 糖尿病 2型 动脉粥样硬化 肾素2血管紧张素系统 贝那普利 厄贝沙坦
EFFECTS OF BENAZEPRIL AND IRBESARTAN ON EARLY VASCULOPATHY IN RATS WITH DIABETES MELLITUS
ZHANG NING, WANG LI²JUN, GAO WEI, et al
(Department of Cardiology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China);
［ABSTRACT］ Objective To observe the effects of benazepril and irbesartan on early vascular lesion in rats with diabetes mellitus (DM) and explore its possible mechanism. Methods Forty male SD rats were evenly randomized to control group (group A), DM group (B), benazepril group (C) and irbesartan group (D). A DM model in rat was established by feeding with high glucose and high fat diet. TC, TG, LDL²C, BG and PGI were measured 16 weeks later. Immunohistochemistry was used to analyze the expression of NF²κB and ICAM²1 in the wall of aorta. Results The levels of TC, TG, LDL²C and BG in groups B, C and D were markedly increased as compared with group A (F=6.18-182.56,q=3.49-28.36,P<0.01), but the levels of above items between these three groups did not show statistical difference (P>0.05). The expressions of NF²κB and ICAM²1, and the numbers of monocyte infiltrating into the intima of the aorta in groups C and D were lower than that in group B (F=37.64-217.33,q=6.01-22.41,P<0.01), and the endothelial damage of the aorta was much slighter. Conclusion Benazepril and irbesartan can prevent early atherogenesis through inhibiting NF²κB activation, ICAM²1 expression and monocyte infilitration.
［KEY WORDS］ Diabetes mellitus, type 2; Renin²angiotensin system; Atherosclerosis; Benazepril; Irbesartan
糖尿病大血管病变是2型糖尿病最常见的慢性并发症之一，是糖尿病致残致死的最主要原因。动脉粥样硬化(AS)是加速糖尿病大血管病变产生的主要因素之一，糖尿病作为一个独立的危险因素，会加速AS的进程，而血管内皮细胞的损伤是AS发生的初始环节[1]。本研究选用与人的AS 形成过程和病理特征很相似的2型糖尿病大鼠作为模型，观察其早期AS 形成时，核转录因子(NF²κB) 和细胞间黏附分子²1 (ICAM²1)活化与表达及内皮下浸润单核细胞数的变化，同时探讨抗肾素²血管紧张素系统（RAS）的一线药物——血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI) 贝那普利和血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）1型受体拮抗剂（ARB）厄贝沙坦对2 型糖尿病大鼠大血管早期AS形成的干预作用，讨论其可能的机制。
1 材料和方法
1.1 材料
胆固醇、胆酸钠、链脲佐菌素（STZ）购自祁东同信生化厂，无水乙醚购自青岛大学医学院附属医院， EliVision试剂盒购于福州迈新生物科技有限公司，兔抗大鼠NFNF²κB、ICAM²1多克隆抗体购于武汉博士德生物工程有限公司。贝那普利由北京诺华公司提供，厄贝沙坦由赛诺非²安万特公司提供。
取健康雄性清洁级SD 大鼠40 只，由青岛大学医学院实验动物中心提供，8周龄，体质量为180～220 g。标准化饲养房笼子喂养,每笼4只，自由进食饮水，每天光照12 h。
1.2 动物分组及AS模型制备
以高糖高脂饮食方法建立糖尿病大鼠AS模型[2]。将40只大鼠,随机分为正常对照组（A组）、2型糖尿病组（B组）、贝那普利组（C组）、厄贝沙坦组（D组），每组10只。B、C、D组喂食高糖高脂饲料（猪油10.0%，蔗糖20.0%，胆固醇2.5%，胆酸钠1.0%，常规饲料66.5%），饮用120 g/L果糖水，1个月后大鼠腹腔注射25 mg/kg STZ(以pH 4.2 的0.1 mol/L 枸橼酸缓冲液配成2.5 g/L)；A组仅注射枸橼酸缓冲液作对照。C组给予贝那普利3 mg/（kg·d）灌胃，D组给予厄贝沙坦20 mg/（kg·d）灌胃，早晚各灌一次，A、B两组给予生理盐水灌胃作对照。所有大鼠均分笼按清洁级动物标准饲养，整个实验周期为16周。
1.3 检测指标和方法
1.3.1 血脂、血糖、胰岛素检测 实验结束时经左心取空腹血标本, 在日立全自动生化分析仪上测定各组稳态血糖（BG）与总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL²C)水平。BG测定采用葡萄糖氧化酶法。血浆稳态胰岛素（PGI）水平测定采用放射免疫法。
1.3.2 病理形态学检查 大鼠用10 g/L戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，左胸切口，经左心室用8.5 g/L氯化钠灌洗，至损伤的右心耳流出液清亮为止。立即剪取胸主动脉同一部位约0.5 cm 长血管段固定于40 g/L缓冲甲醛液过夜，石蜡包埋，横断面连续切片，厚4 μm，行苏木精²伊红染色，观察病理形态学改变。
1.3.3 NF²κB、ICAM²1的免疫组化检测 实验结束后用戊巴比妥过量麻醉处死大鼠, 取病变部位血管等距切分4～5段，用40 g/L中性缓冲甲醛固定，石蜡包埋。血管标本横截面连续切片，厚4 μm, 间隔100 μm再次切片，共切3个层面。用SABC三步法进行NF²κB、ICAM²1免疫组化染色：体积分数0.03过氧化氢灭酶，微波修复，一抗稀释度均为1∶150，室温孵育1 h，DAB显色，苏木精复染。NF²κB抗体以血管内皮细胞核内出现棕黄色颗粒物质为阳性，ICAM²1以细胞膜和细胞质黄染为阳性。计数高倍镜下同一切片内全部阳性细胞及内皮细胞数，计算NF²κB与ICAM²1的阳性率。应用彩色病理图文分析系统计算病理切片组织中阳性染色面积与视窗面积的百分比。
1.4 统计学处理
实验数据使用SPSS 11.0统计软件进行分析。结果均以±s表示, 多组比较采用方差分析。
2 结果
2.1 血糖、胰岛素、血脂检测
实验过程中B组1只大鼠因神经病变死亡，其他大鼠一般状况良好。B、C、D组BG水平较A组显著升高(F=64.31,q=15.48～16.23，P<0.01)，而PGI水平无明显差异（F=1.08，P>0.05）。B、C、D组TC、TG、LDL水平较A组显著升高(F=6.18～182.56，q=3.49～28.36，P<0.01), 但3组之间水平差异无显著意义(q=0.66～1.33，P>0.05）。见表1。
2.2 组织形态学改变
A组大鼠主动脉血管内膜光滑，镜下可见内皮细胞完整，单层紧贴内弹力板，中膜厚度均一，主要为收缩型平滑肌细胞。B组大鼠主动脉管壁可见有少量黄色脂样斑块向管腔凸出，主要分布于近主动脉弓处，呈片状分布，为局灶性；镜下见内皮细胞体积增大，部分脱落，连接间隙增大，内皮表面黏附较多单核细胞，内膜有很多单核细胞浸润，并可见到巨噬细胞和脂肪空泡，胞质中线粒体肿胀，中膜可见合成型平滑肌细胞。C、D组大鼠病变与B组相似，但程度较轻，内膜较完整平坦,内皮黏附及浸润于内膜单核细胞明显少于B组，内膜增厚明显轻于B组。
2.3 免疫组化及各观察指标的变化
A组仅见较少的棕黄色颗粒状阳性染色物质；B组可见大量的棕黄色颗粒状阳性染色物质,部分融合成片，阳性染色百分比明显高于正常对照组；C、D组棕黄色颗粒状阳性染色物质明显少于B组，但多于A组。
各组NF²κB、ICAM²1阳性细胞率和单核细胞数比较，差异有统计学意义(F=37.64～217.33,P<0.01)。NF²κB阳性细胞率C组、D组低于B组（q=9.08、7.58，P<0.01），但高于A组（q=6.01、7.55,P<0.01）；ICAM²1阳性细胞率C组、D组亦明显低于B组（q=16.07、15.41，P<0.01），明显高于A组（q=20.28、20.97，P<0.01）；浸润于内膜的单核细胞C组、D组明显少于B组（q=22.41、19.82，P<0.01），但明显多于A组（q=9.69、12.36，P<0.01）。见表2。
3 讨论
糖尿病血管病变是糖尿病的慢性并发症之一，是糖尿病病人致残、致死的最主要因素。糖尿病血管病变的病理改变主要是AS，与非糖尿病血管病变相比，其病理改变重，发病年龄轻，进展快[3]。NF²κB是一种广泛存在于细胞中的多显性转录因子,它调控着细胞黏附分子、细胞因子、生长因子和免疫受体等基因转录[4,5]，可能是AS发生的始动机制之一。在血管内皮早期AS 病变的发生过程中，NF²κB 的激活是最早发生的[6]。细胞间ICAM²1作为一种炎性标志物，通过介导白细胞与血管内皮细胞的黏附与浸润，参与多种炎症及免疫过程来启动AS的发生[7]。AS 具有炎症的基本特征，有变质、渗出和增生等过程，启动阶段由各种危险因素损伤血管内皮[8]。2 型糖尿病伴随的高糖血症、高脂血症、高胰岛素血症等使机体氧化能力增强，激活RAS 使自由基产生增加，自由基可损伤血管内皮细胞。内皮细胞受到损伤后，通过NF²κB使黏附分子如ICAM²1、E²选择素与VCAM²1 的mRNA 表达增加，从而使更多的单核细胞黏附于内皮细胞表面，形成动脉粥样斑块，这是血管性疾病发生发展的关键性步骤。
表1 各组血糖、血脂与胰岛素水平比较（略）
表2 各组NF²kB、VCAM²1阳性细胞率和单核细胞数比较（略）
RAS是一个重要的水电解质平衡调节系统。RAS的各种阻滞剂广泛应用于高血压和充血性心力衰竭的治疗和研究中，第一类是熟知的ACEI，第二类是竞争性的ARB，第三类是正在研究中的选择性肾素抑制剂。ACEI对心脏和血管的保护作用主要通过对组织中AngⅡ的抑制并作用于激肽²激肽释放酶系统实现的。抑制局部AngⅡ的生成，心脏和血管中AT1受体表达下降，局部醛固酮生成减少，从而减少局部缓激肽降解，使之局部浓度增加，使心脏氧供给平衡，这是其保护作用的主要方面。ACEI可以抗AS、改善心肌缺血，逆转左心室肥厚且改善心功能。ARB的开发和应用，是近年来心血管药物治疗学的一大进展。与ACEI相比，AT受体拮抗剂对RAS系统阻滞更完全更直接，但AT受体拮抗剂不影响缓激肽降解，不具有ACEI通过增加缓激肽活性而引起的对某些器官的保护作用，其疗效尚待进一步验证。
本实验采用高糖高脂饮食制作SD 大鼠糖尿病模型，形态学观察显示B组大鼠主动脉内皮受损明显，大量单核细胞黏附及浸润于内膜，血管平滑肌细胞(VSMCs) 增生，这些都是早期AS形成的特征；血糖水平显著升高伴胰岛素敏感性降低，说明2型糖尿病模型制作成功。贝那普利和厄贝沙坦并不能降低糖尿病大鼠血糖与血脂水平；主动脉组织免疫组化显示，药物干预组血管壁NF²κB 及ICAM²1的表达和浸润的单核细胞数明显少于B组，但仍高于A组。ACEI和ARB对糖尿病大血管AS的保护作用主要通过抑制RAS、减少血管壁中自由基生成，从而保护内皮细胞，防止脂质过氧化，防止NF²κB 活化，抑制VSMCs 表型转化和增殖,从而多途径发挥抗早期AS作用。
RAS与早期AS 形成有密切的关系，贝那普利和厄贝沙坦在不同环节抑制RAS 从而发挥抗AS作用。两者抗AS 机制可能有所不同,对于不同动物、不同剂量和不同给药方式其效果可能有所差别,这些还需进一步研究。RAS 与AS 关系和机制的进一步明确将会为AS 防治提供新的策略,扩大ACEI 和ARB在临床工作中的应用。
【参考文献】
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作者单位：青岛大学医学院附属医院，山东 青岛 266003 心内科; 东区内科