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【摘要】 目的 探讨非小细胞肺癌（NSCLC）组织核苷酸切除修复基因1（ERCC1）和乳癌易感基因1（BRCA1）的表达以及新辅助化疗对两者表达的影响。方法 应用免疫组化PV二步法检测110例NSCLC组织（50例术前行新辅助化疗，60例行常规手术而术前未经化疗）ERCC1、BRCA1的表达。结果 ERCC1主要在NSCLC组织细胞核表达，细胞浆有少量表达，总阳性表达率为59.09%。BRCA1在细胞核表达，总阳性表达率为74.55%。ERCC1、BRCA1表达强度与性别、年龄、组织学类型、肿瘤细胞分化程度、临床分期及有无淋巴结转移均无关（u=-1.557～-0.032，H=0.003～3.151，P>0.05）。新辅助化疗组ERCC1、BRCA1总阳性表达率为68.00%、80.00%，单纯手术组为51.67%、70.00%，两组比较差异有显著性（u=-2.365、-3.011，P<0.05）。ERCC1与BRCA1的表达强度呈显著正相关（r=0.264，P<0.01）。结论 新辅助化疗可以影响NSCLC组织中ERCC1、BRCA1的表达，从而影响肿瘤对顺铂化疗的敏感性，在肿瘤化疗中应予重视。
【关键词】 癌 非小细胞肺 DNA修复 新辅助化疗
肺癌是严重威胁人类健康的疾病之一，是肿瘤死亡的首要原因。对其中占绝大多数（80%）的非小细胞肺癌（NSCLC），现在多用手术切除加术后辅助化疗的综合治疗方法，但治疗效果并不乐观。新辅助化疗是NSCLC治疗中的新进展，临床多应用以顺铂为基础的化疗方案。近年来新辅助化疗在众多基础研究及临床实践中已经显示出了优越性，认为可以提高肿瘤切除率、无瘤生存率和总生存率［１］。但新辅助化疗对肿瘤耐药性的影响往往被忽视。现有研究发现，DNA修复家族成员核苷酸切除修复基因1（ERCC1）和乳癌易感基因1（BRCA1）是较好的化疗疗效预测指标，认为两者阳性表达与顺铂耐药性密切相关［2］。而联合检测两者在NSCLC新辅助化疗前后的表达情况目前尚未见报道。本研究探讨ERCC1、BRCA1在NSCLC组织的表达情况及新辅助化疗对两者表达的影响，以有助于预测新辅助化疗对肿瘤化疗敏感性的影响和指导NSCLC的个体化治疗。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 标本
随机收集2002～2007年青岛大学医学院附属医院经病理证实的NSCLC手术切除标本110例，男90例，女20例；年龄≤55岁46例，>55岁64例。其中术前行含铂方案新辅助化疗（新辅助化疗组）50例，术前未经化疗（单纯手术组）60例。新辅助化疗组均给予以顺铂为基础的联合化疗(其中36例为NP方案：诺维本+顺铂，14例为GP方案：健择+顺铂)，术前行2周期化疗，化疗后3周左右手术。标本均经40 g/L中性甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，切片，苏木精-伊红染色后复核病理诊断并按WHO标准分型、分级。鳞癌51例，腺癌59例；高分化17例，中分化36例，低分化57例；按1997年肺癌国际分期修正系统进行TNM临床分期:Ⅰ期42例，Ⅱ期21例，Ⅲ期47例；有淋巴结转移65例，无淋巴结转移45例。
1.2 试剂
鼠抗人ERCC1单克隆抗体、PV-9000检测试剂盒及DAB显色剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。鼠抗人BRCA1单克隆抗体购自福州迈新生物技术开发有限公司。
1.3 免疫组织化学染色
所有组织标本4 μm厚连续切片、二甲苯脱蜡、系列乙醇水化至蒸馏水，采用体积分数0.03的过氧化氢灭活内源性过氧化物酶，ERCC1行高压修复， BRCA1行微波修复，采用免疫组织化学PV-9000二步法染色，DAB显色，苏木精复染，封片。用PBS代替一抗作为阴性对照，用已知的阳性切片作为阳性对照。
1.4 结果判定
ERCC1以肿瘤细胞核和(或)细胞浆出现棕黄色颗粒着色为阳性，BRCA1以肿瘤细胞核出现棕黄色颗粒着色为阳性。参照文献［3］制定免疫组化标准：每例标本在400倍视野下随机选取500～1 500个肿瘤细胞，观察阳性细胞染色强度，并计数阳性细胞百分数。按细胞染色强度记为0～3分：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，深棕色或棕褐色为3分。按阳性细胞百分数的构成比记为0～3分：<10%为0分，10%～25%为1分，26%～50%为2分，>50%为3分。以染色强度记分和阳性细胞百分数记分相加所得总分进行判断，总分0～1分为阴性（-），2～3分为弱阳性（+），4～5分为中阳性（），6分为强阳性（）。
1.5 统计学分析
采用SPSS 11.5及PPMS 1.5［4］统计软件进行数据处理，两指标表达强度与临床病理特征间的关系分别采用Kruskal-Wallis及Mann-Whitney秩和检验进行比较；两指标间的相互关系采用Spearman相关分析。
2 结 果
2.1 ERCC1在NSCLC中的表达
110例NSCLC中表达-者45例（40.91%），+者38例（34.55%），者15例（13.64%），者12例（10.91%），总阳性表达率59.09%。
2.2 BRCA1在NSCLC中的表达
110例NSCLC中表达-者28例（25.45%），+者32例（29.09%），者27例（24.55%），者23例（20.91%），总阳性表达率74.55%。
2.3 ERCC1、BRCA1表达与NSCLC病人临床病理特征间的关系
ERCC1、BRCA1的表达强度与NSCLC病人的性别、年龄、肿瘤病理类型、分化程度、临床分期及有无淋巴结转移均无关（u=-1.557～-0.032，H=0.003～3.151，P>0.05）。见表1、2。
2.4 新辅助化疗对NSCLC病人ERCC1表达影响
新辅助化疗组ERCC1表达阳性者34例，总阳性表达率为68.00%，单纯手术组表达阳性者31例，总阳性表达率为51.67%。新辅助化疗组病人ERCC1的表达强度高于单纯手术组（u=-2.365，P<0.05）。见表1。
2.5 新辅助化疗对NSCLC病人BRCA1表达影响
新辅助化疗组BRCA1表达阳性者40例，总阳性表达率为80.00%，单纯手术组表达阳性者42例，总阳性表达率为70.00%。新辅助化疗组病人BRCA1表达强度高于单纯手术组（u=-3.011，P<0.01）。见表2。
2.6 ERCC1、BRCA1在NSCLC中表达的相关性
110例NSCLC病人中ERCC1及BRCA1的表达均为阳性者53例，均为阴性者16例， ERCC1与BRCA1表达强度间呈显著正相关（r=0.264，P<0.01）。见表3。
3 讨 论
新辅助化疗早期多用于ⅢA期NSCLC病人，可以增加肿瘤完全切除的机会，近年来，新辅助化疗在早期NSCLC中的临床试验也已经展开并初步取得了肯定结果。多项研究结果显示，新辅助化疗可以降低肿瘤分期、提高病人生存率、消除或控制全身微转移病灶和预防复发转移。同时，可评价化疗敏表1 NSCLC病人ERCC1的表达与临床病理特征和新辅助化疗的关系(例)表2 NSCLC病人BRCA1的表达与临床病理特征和新辅助化疗的关系(例)表3 ERCC1、BRCA1在NSCLC中表达的相关性(例) 感性［5］。但涉及新辅助化疗对肿瘤耐药性影响的研究少见。顺铂是现今临床上NSCLC新辅助化疗方案中必不可少的一线药物。它抗癌作用的主要靶点为DNA，与其共价结合形成顺铂-DNA复合物，导致DNA链间交联或链内交联，引起DNA损伤，从而阻止DNA复制及转录，造成细胞死亡［6］。DNA损伤修复基因ERCC1、BRCA1可以修复顺铂等多种原因所引起的DNA损伤，其中ERCC1主要参与DNA损伤的核苷酸切除修复，可以识别并切割DNA的损伤部位［7］。另外，BRCA1作为一种抑癌基因，主要参与DNA的双链损伤修复［8］。ERCC1、BRCA1的过表达可以使损伤的DNA迅速修复，从而导致瘤细胞对顺铂的耐药。研究显示，ERCC1、BRCA1的表达与NSCLC、胃癌、卵巢癌和乳癌等多种肿瘤的顺铂化疗疗效显著相关，高表达者对顺铂化疗耐药，而低表达者对顺铂化疗敏感性好〖9,10〗。本文结果显示，NSCLC中存在ERCC1、BRCA1的表达。ERCC1总阳性率59.09%，BRCA1总阳性率74.55%，与TETSUYA等［11］研究结果相似。
现有研究中ERCC1、BRCA1的表达与NSCLC的病理类型、临床分期、分化程度等临床病理特征的关系意见不一。有研究结果显示，ERCC1的表达与NSCLC病理类型有关，鳞癌的表达水平高于腺癌［8］。本研究结果与之不同，可能与研究标本中鳞癌和腺癌的构成比不同有关，国外学者的研究标本中腺癌（32%和39.2%）均少于鳞癌（56%和51.5%），而本研究标本中腺癌（53.64%）多于鳞癌（46.36%）。另外，OLAUSSEN等［9］的研究中对入组IALT前瞻性研究的761例NSCLC组织检测ERCC1的表达，还发现其表达与病人的性别、年龄相关。本研究未显示ERCC1、BRCA1表达与临床病理特征的相关性，与TARON等［12］的研究结果一致，而且他们的研究中都含有新辅助化疗的病例，分别应用免疫组化的方法检测51例行新辅助化疗和39例行单纯手术的NSCLC组织中ERCC1蛋白的表达，以及荧光定量PCR的方法检测51例行新辅助化疗的NSCLC组织中BRCA1 mRNA的表达情况，结果均显示两者表达与临床病理特征无关。提示新辅助化疗可能影响ERCC1、BRCA1表达与临床病理特征的关系，进一步的细化实验设计可能有助于探讨两者的相关性。
另外，本文新辅助化疗组ERCC1、BRCA1表达强度均高于单纯手术组，说明新辅助化疗的应用可能诱导两者的表达增高，进而影响肿瘤对顺铂化疗的敏感性。以往有报道乳癌新辅助化疗也可引起ERCC1表达的增加和顺铂耐药［13］。因此，临床上应该严格选择新辅助化疗的适用对象，不应滥用，以免影响病人术后化疗的效果。同时，对应用新辅助化疗的病人，可通过检测ERCC1、BRCA1在新辅助化疗后的表达水平，了解肿瘤对铂类药物敏感性的情况，高表达者术后化疗时应该避免使用铂类药物。
ROSSELL等［14］曾用荧光定量PCR的方法检测NSCLC中ERCC1和BRCA1的表达情况，发现两者mRNA的表达水平高度相关。另有学者研究结果显示，ERCC1和BRCA1 mRNA的表达在对顺铂敏感性的影响上起正协同作用［9］。本实验用免疫组化的方法也证实ERCC1、BRCA1蛋白的表达在NSCLC中呈正相关。联合检测两者的表达水平可以更好地预测顺铂化疗的敏感性。另外，ERCC1不仅参与DNA损伤修复的核苷酸切除修复，而且在DNA的双链损伤修复，特别是由链内交联引起的双链损伤中也起一定作用。同样，BRCA1主要参与DNA双链损伤修复，但核苷酸切除修复的进行也有赖于它的存在，说明ERCC1和BRCA1在引起顺铂耐药的机制中有一致的地方，这可能是两者表达具有相关性的原因，而两者协同作用的具体机制尚待进一步探讨。
总之，新辅助化疗可影响NSCLC组织DNA修复基因ERCC1、BRCA1的表达，进而影响肿瘤对顺铂的敏感性。因此，应用新辅助化疗时应该严格选择适用对象，而且对新辅助化疗后两者明显升高的病人，术后辅助化疗可以选择非铂的化疗方案，以提高疗效。检测新辅助化疗对ERCC1、BRCA1表达的影响，有助于探讨新辅助化疗对肿瘤耐药性的影响和指导NSCLC的个体化治疗。
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作者单位：青岛大学医学院病理学教研室，山东 青岛 266021