As2O3对人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤抑制作用及机制

【摘要】  目的 探讨不同剂量的三氧化二砷（As2O3）对人卵巢癌细胞株SKOV3细胞裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用及其机制。方法 将4×106个SKOV3细胞接种于裸鼠皮下，建立人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型，随机分为As2O3高、中、低剂量组及生理盐水组（空白对照）、卡铂(CBP)组（阳性对照），连续给药10 d，停药后24 h处死裸鼠，计算移植瘤的瘤质量、抑瘤率及caspase3基因表达水平的变化，并检测用药后裸鼠的肝、肾功能及血常规。结果 As2O3对移植瘤生长的抑制作用具有剂量依赖性，各剂量As2O3组及CBP组瘤质量与生理盐水组比较均有统计学意义（F=17.931,P<0.05）；As2O3作用后caspase3基因的表达较空白对照组升高，差异有统计学意义（F=31.821，q=2.89～3.84,P<0.05）。同时，As2O3各组与CBP组相比，未表现出明显的肝、肾及血液学毒性。结论 As2O3对人卵巢癌移植瘤的生长具有明显的抑制作用，其机制可能与上调caspase3基因的表达及诱导细胞凋亡有关。

【关键词】  三氧化二砷；卵巢肿瘤；抗肿瘤药；caspase3基因

ANALYSIS OF ANTITUMOR MECHANISM OF ARSENIC TRIOXIDE ON THE SUBCUTANEOUSLY TRANSPLANTED TUMOR OF HUMAN OVARIAN CARCINOMA IN NUDE MICE  DING XIAODI, ZHAO YUANYUAN, YU LI, et al (Department of Oncology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China); ［ABSTRACT］ Objective To explore the inhibitory action of arsenic trioxide (As2O3) on the growth of SKOV3 cell subcutaneously implanted tumor in nude mice.  Methods Nude mice received implanted SKOV3 cells (4 ×106) were then treated with intraperitoneal injection of different concentration of As2O3, or CBP, as controls, for 10 days. The weight of implanted tumors and the tumor inhibition rate were observed to evaluate the antitumor effect of As2O3. The gene expression of caspase3 was detected by realtime RTPCR.  Results As2O3 and CBP, compared with saline, significantly inhibited the growth of transplanted tumor (P＜0.05), and furthermore, the inhibitory effect of As2O3 was dosedependent. The expression of caspase3 was significantly upregulated in the As2O3 group in contrast to the saline group (P＜0.05). As2O3 showed less haematological toxicity and no hepatic and nephritic toxicity compared with CBP.  Conclusion As2O3 can inhibit the growth of implanted human ovarian carcinoma, the mechanism may be related to the upregulation of the activity of caspase3 and the cell apoptosis in vivo.

    ［KEY WORDS］ Arsenic trioxide; Ovarian neoplasms; Antineoplastic agents; caspase3 gene

    三氧化二砷 (As2O3) 是我国传统中药砒霜的有效成分之一，作为一种新型抗癌药物，已成功地应用于人类白血病的治疗[1]，在人类多种实体肿瘤的体外实验中证明其有良好的抑瘤效果[2,3]。体外实验研究显示，As2O3可通过诱导细胞凋亡及分化等多途径、多机制抑制卵巢癌的生长及远处转移[4]，但在裸鼠体内作用鲜有报道。本实验在裸鼠皮下接种人卵巢癌细胞株SKOV3 细胞，建立移植瘤模型，观察As2O3 对移植瘤生长的抑制作用，并对其作用机制进行初步探讨。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    人卵巢癌细胞株SKOV3细胞由中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心提供；As2O3 由哈尔滨伊达药业有限公司提供；卡铂（CBP） 由齐鲁制药厂提供。雌性BALB/C nu/nu裸鼠30只，4～6周龄,体质量14～16 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司（SLAC）提供，饲养于SPF级动物实验室。

    1.2  方法

    1.2.1  细胞培养和动物模型的建立  人卵巢细胞株SKOV3 细胞在RPMI1640 培养液(含体积分数0.10胎牛血清、105 U/L青霉素、105 U/L 链霉素) 中，在37 ℃、体积分数0.05的CO2条件下培养至对数生长期， 2.5 g/L胰酶消化，制备单细胞悬液，调整密度至2×1010/L，即0.2 mL溶液中含4×106个细胞。在超净工作台内于裸鼠肩背部的皮下注射0.2 mL单细胞悬液，注射局部出现明显皮丘，7 d后所有裸鼠均出现直径大于5 mm的皮下结节，移植瘤模型建立成功。

    1.2.2  实验分组  于接种后第8天将已经建成皮下移植瘤模型的30 只裸鼠随机分为5 组，即生理盐水（NS）组，卡铂（CBP）组，高、中、低剂量As2O3组（1.0、2.5、5.0 mg/kg）,每组6 只，每只大鼠腹腔给药0.2 mL。CBP组给予CBP60 mg/kg。各组均连续给药15 d。

    1.2.3  抑瘤率观察  停药后第2天处死裸鼠，剥离瘤组织，称取瘤质量，计算抑瘤率，即抑瘤率＝（1－实验组平均瘤质量/对照组平均瘤质量）×100%。

    1.2.4  细胞凋亡率的检测及caspase3活性的测定于移植瘤周边取部分肿瘤组织，固定于体积分数为0.70冰乙醇，通过研磨及胃蛋白酶消化后制备成单细胞悬液，低速离心去细胞碎片、PBS洗涤，离心分离部分细胞，于室温避光PI染色后上流式细胞仪进行细胞凋亡率的测定。另离心分离部分细胞，采用triton细胞打孔后加入PE标记的活性caspase3抗体，同时设立空白染色对照组，染色0.5 h后上流式细胞仪进行caspase3活性的测定。采用Cellquest 3.1f收集细胞，Modfit 2.0软件进行数据分析。

    1.2.5  Realtime RTPCR  按照RNArose 说明书提取瘤组织中总RNA，分光光度计检测260 nm/280 nm波长处吸光度比值，选取比值在1.8～2.1之间的RNA样本，采用TaKaRa的反转录体系进行反转录反应以合成cDNA，以管家基因GDPH为对照，采用Taq探针法应用RG3000 Real Time PCR(基因有限公司生产)扩增仪进行PCR反应。TaKaRa PCR反应体系20 μL，反应条件为95℃变性5 s，60 ℃退火及延伸30 s，40个循环。用Roche Light Cycler probe design software 2.0软件设计引物及探针，caspase3前后引物序列分别为5′AAATACCAGTGGAGGCCGACTT3′和5′AAGCTTGTCGGCATACTGTTTCA3′，Taq探针序列分别为5′TGGCTCCTGGTTCATCCAGTCGCGCTT3′；GDPH前后引物序列分别为5′GCCAAAAGGGTCATCATCTC3′,5′GGCCATCCACAGTCTTCT3′,Taq探针序列为5′AAGATCATCAGCAATGCCTCCTGC3′。caspase3基因表达相对定量分析采用2-ΔΔCT法[5],CT值为荧光信号达到阈值时的循环数,ΔCT为同一样本达到阈值时靶基因caspase3与对照基因GDPH扩增所需的循环数差值，即ΔCT=CT(caspase3)-CT(GDPH),2-ΔCT值代表经GDPH校正后的靶mRNA的数目。

　　2  结    果

    2.1  As2O3 对裸鼠移植瘤的抑瘤率

    各剂量As2O3组及CBP组瘤质量明显低于NS组，差异有统计学意义（F=17.931,P<0.05）。见表1。

    2.2  As2O3诱导移植瘤细胞的凋亡作用

    流式细胞仪分析显示，As2O3各组及CBP组均出现典型亚G1期凋亡峰，NS组、CBP组及各剂量 As2O3组凋亡率分别为（7.67±0.69）%、（13.84±0.72）%、（19.38±1.46）%、（17.39±0.81）%、（17.98±1.27）%，各剂量As2O3组凋亡率均高于NS组及CBP组（F=307.941,P<0.05）。不同剂量的As2O3诱导凋亡的作用不同，以低剂量As2O3 组凋亡率最高，而中、高剂量As2O3组凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)。

    2.3  caspase3基因的表达

    caspase3及GDPH扩增标准曲线斜率分别为3.465及3.431，提示目的基因及管家基因进行PCR反应时扩增效率近乎相等，故可采用2-ΔΔCT法进行基因表达量的相对分析。规定NS组基因表达量为1，则得CBP组及低、中、高剂量As2O3组基因表达相对量，低剂量As2O3组caspase3基因表达显著高于其他剂量组，各剂量As2O3 组与NS组差异均有统计学意义（F=31.821，q=2.89～3.84,P<0.05）。见表2。表1  As2O3对卵巢癌裸鼠移植瘤的抑制作用表2  裸鼠移植瘤组织中caspase3基因相对表达量比较

    2.4  不良反应

    实验用药过程中各剂量As2O3组及NS组裸鼠精神状态均良好，活动正常，反应敏捷，进食、饮水正常，皮肤颜色如常，大小便正常。CBP组裸鼠用药后精神逐渐萎靡不振，活动减少，反应迟钝，不同程度进食下降，出现迅速消瘦等恶病质表现。实验期间荷瘤鼠无自然死亡。用药后各剂量As2O3组及NS组裸鼠体质量继续增加。各组均出现不同程度的白细胞计数降低，以CBP组为著（F=103.549，P<0.05）。见表3。表3  As2O3对裸鼠血常规及肝肾功能的影响

    3  讨    论

    恶性卵巢肿瘤是常见的妇科肿瘤，由于其早期症状不明显，病人就诊时大多已属晚期，对其治疗目前仍以手术和以cDDP 为基础的联合化疗为主。但由于肿瘤细胞对cDDP 的原发性和继发性耐药，以及cDDP 的肝、骨髓毒性作用，限制着恶性卵巢肿瘤的化疗效果。As2O3在体外对人卵巢癌细胞具有周期阻滞及诱导凋亡作用，且具有时间及剂量依赖性，在较低浓度时，随浓度升高凋亡率升高。

    本实验结果显示，低剂量As2O3与常用卵巢癌化疗药物CBP的抑瘤率分别为76.9% 及50.0%，与NS组比较差异有显著性，但上述两组比较差异无统计学意义，说明低剂量As2O3在体内有显著抑制人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤生长的作用，与CBP有相同的抗肿瘤作用。但其抗肿瘤活性没有随As2O3剂量的增高而增强,随As2O3浓度的增高其抑瘤率反而下降,1.0 mg/kg是否为其抗肿瘤作用的最佳浓度，增大剂量后会否再次出现抗肿瘤作用点以及其机制等问题有待进一步研究证实。实验中我们观察了各组对药物的不良反应，As2O3的毒性作用明显低于CBP，尤其是在血液学毒性方面，且无肝肾毒性，其引起体质量的增加提示As2O3可能具有潜在的抗恶病质的作用，本实验结果也说明这一点。

    凋亡是细胞区别于坏死的主动的、程序化的细胞死亡过程，是受多基因调控的细胞的自杀现象。caspase3作为细胞凋亡中最关键的效应酶，它的活化将引起细胞不可逆的凋亡，是细胞凋亡的中心分子及细胞发生凋亡的标志，在细胞凋亡中起着关键的作用，反映了凋亡启动因素存在和凋亡发生的双重生物学效应。为探讨caspase3是否为As2O3 作用的靶点，本研究采用实时定量RTPCR对各组移植瘤内的caspase3的基因相对表达量进行研究，结果表明各剂量As2O3 组caspase3的表达均较NS组增加，As2O3可诱导caspase3基因表达的增加，但以低剂量组表达增加最为显著，该结果与低剂量As2O3组抑瘤率及凋亡率最高的结果相一致，证明提高caspase3的表达量进而诱导凋亡是As2O3抑制肿瘤生长的机制。既往研究发现，在人卵巢癌耐药细胞系中caspase3的活性明显低于敏感细胞系，这也可能是卵巢癌对顺铂耐药的机制之一，通过增强caspase3的活性，可部分恢复耐药细胞对顺铂的敏感性[6]。本文结果显示，As2O3 能够增强caspase3的活性，提高其表达，为联合用药提供了理论依据。至于As2O3的抗卵巢癌作用是否存在其他的机制，还需要进一步的研究证实。

【参考文献】
  [1]王欢,王慧涵,刘卓刚,等. 三氧化二砷治疗初诊急性早幼粒细胞白血病的效果[J]. 齐鲁医学杂志, 2007,22:383385.

[2]EVENS A M, TALLMAN M S, GARTENHAUS R B. The potential of arsenic trioxide in the treatment of melignantdisease: past,present,and future[J]. Leuk Res, 2004,28:891900.

[3]CHENG B H, YANG X X, HAN Z W. Arsenic trioxide induced the apoptosis of laryngeal cancer via downregulation of survivin mRNA[J]. Auris Nasus Larynx, 2008,35:95101.

[4]ZHANG J J, WANG B. Arsenic trioxide (As2O3) inhibits peritoneal invasion of ovarian carcinoma cells in vitro and in vivo[J]. Gyn Onc, 2006,103:199206.

[5]LIVAK K J, SCHMITTGENT D. Analysis of relative gene expression data using realtime quantative PCR and the 2 (-Delta CT) methods[J]. Methods, 2001,25:402408.

[6]YANG X, FRASER M, MOLL U M, et al. Aktmediated cisplatin resistance in ovarian cancer: modulation of p53 action on caspasedependent mitochondrial death pathway[J]. Cancer Res, 2006,66(6):31263136.

作者单位：青岛大学医学院附属医院肿瘤科，山东 青岛 266003