RECK及MMP2在骨肉瘤组织中的表达及意义

【摘要】  　　目的 检测RECK蛋白及明胶类基质金属蛋白酶2（MMP2）在骨肉瘤组织表达,探讨其在骨肉瘤的发生、发展、浸润和转移中的作用。方法 选择临床及病理资料完整的存档骨肉瘤标本30例,另取骨软骨瘤标本10例作为对照。采用 PV6000免疫组化方法检测RECK及MMP2蛋白的表达。结果 RECK在骨肉瘤组织中低表达(30.0%)，在骨软骨瘤组织中高表达（80.0%）,两者相比差异有显著性（χ2=5.76,P<0.05）； MMP2在骨肉瘤组织中高表达(76.7%)，在骨软骨瘤组织中低表达（10.0%）,两者相比差异有显著性(χ2=11.25,P<0.05)；骨肉瘤组织中RECK与MMP2的表达呈负相关(r=－0.84,P<0.05)。结论 骨肉瘤组织中RECK低表达,而MMP2高表达。RECK及MMP2可能作为预测骨肉瘤浸润转移的重要指标。

【关键词】  骨肉瘤；RECK；明胶酶A；免疫组织化学

　　EXPRESSION AND SIGNIFICANCE OF REVERSIONINDUCING CYSTEINERICH PROTEIN WITH KAZAL MOTIFS AND MATRIX METALLOPROTEINASE2 IN OSTEOSARCOMA 

　　WU HE, YANG CHUANMIN, DONG QIAN, et al

　　(Department of Pediatric Surgery, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China) ;
　　［ABSTRACT］ Objective To detect the expressions of reversioninducing cysteinerich protein with Kazal motifs (RECK) and matrix metalloproteinase2 (MMP2) in osteosarcoma, and explore their correlation with the occurrence, development, invasion, and metastasis of the tumor. Methods PV6000 immunohistochemistry was used to measure the expressions of RECK and MMP2 in 30 samples of osteosarcoma with complete clinicopathological data, and another 10 cases of osteochondroma served as a control. Results The expression rate of RECK in osteosarcoma was low (30.0%), and that in osteochondroma was high(80.0%), the difference between them being significant (χ2=5.76,P<0.05).The expression of MMP2 in osteosarcoma was high (76.7%), and that in osteochondroma was low (10.0%), the difference between them was also significant (χ2=11.25,P<0.05). The expression of RECK was negatively correlated with that of MMP2 in osteosarcoma(r=-0.84,P<0.05). Conclusion In osteosarcoma, the expression of RECK is low, and expression of MMP2 is high. RECK and MMP2 may be served as important markers to predict the infiltration and metastasis of this malignancy.
   
　　［KEY WORDS］ osteosarcoma; reversioninducing cysteinerich protein with Kazal motifs; gelatinase A; immunohistochemistry
   
　　骨肉瘤(OS)是儿童和青少年最常见的恶性骨肿瘤，其恶性度高，易早期发生远处转移(尤其是肺转移)，成为病人死亡的主要原因。因此，探讨OS早期侵袭转移机制具有重要的意义。RECK基因是新近发现的抑癌基因。有研究表明,RECK是通过负性调节基质金属蛋白酶2(MMP2)、MMP9、膜型基质金属蛋白酶1 (MT1MMP)来抑制肿瘤的侵袭和转移[14]。本研究采用免疫组织化学方法分别检测RECK和MMP2蛋白在OS组织中的表达情况,进一步阐明两者在OS发生、发展、浸润和转移中的分子机制,为OS的诊断和治疗提供理论依据。现将结果报告如下。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料来源
   
　　选用我院临床及病理资料完整的OS标本30例及骨软骨瘤标本10例,其中OS组中男19例,女11例，年龄6.3～22.0岁，平均13.6岁；骨软骨瘤组中男6例，女4例，年龄5.5～12.5岁，平均8.3岁。按ENNEKING分期标准，30例OS中Ⅰ期8例，Ⅱ期8例，Ⅲ期14例。按病理类型划分，骨母细胞型OS者14例，软骨母细胞型OS者4例，纤维母细胞型OS者3例，毛细血管扩张型OS者4例，其他类型者5例。按肿瘤发生部位划分，股骨14例，胫骨8例，其他部位8例。按有无肺转移划分，无肺转移12例，有肺转移18例。在获得病理标本前，所有病人均未进行特殊治疗。

　　1.2  仪器及试剂
   
　　浓缩型兔抗人RECKmAb试剂购于美国Santa Cruz公司,MMP2兔抗人mAb购于武汉博士德生物制品有限公司,PV6000免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司。免疫组织化学染色所需的常规试剂及设备均由我院病理科提供。

　　1.3  标本的处理
   
　　所有标本均常规脱钙，40 g/L的甲醛溶液固定，石蜡包埋，3 μm厚切片。采用PV6000 免疫组化方法检测RECK及MMP2蛋白在OS组织及骨软骨瘤组织的表达。一抗工作浓度:RECK为1∶100,MMP2为1∶100。PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照，所有操作均按照说明书严格执行。

　　1.4  结果判定
   
　　RECK及MMP2蛋白阳性信号均呈棕黄色颗粒状，主要位于细胞质内。高倍镜下观察细胞，随机选取5～10个视野（每个视野观察细胞数不少于200个），按阳性细胞所占百分比及着色深浅进行结果判定[5]。①按切片中细胞着色深浅评分：0分，细胞无显色；1分，细胞显色浅黄色；2分，细胞显色棕黄色；3分，细胞显色棕褐色。②按阳性细胞数占同类细胞数的百分比评分：<30%为1分，30%～70%为2分，>70%为3分，取①、②两项评分的乘积作为总积分，0～1分为阴性（-），2～3分为弱阳性（+），≥4分为阳性（）。

　　1.5  统计学处理
   
　　采用SPSS 15.0及PPMS 1.5[6]统计软件进行统计学处理，计数资料比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有显著性。

　　2  结果

　　2.1  RECK及MMP2在两组中的表达情况
   
　　两组间RECK及MMP2表达阳性率比较差异有显著性(χ2=5.76、11.25，P<0.05)。见表1。表1  两种组织RECK及MMP2表达情况（略）

　　2.2  RECK及MMP2在OS组中的表达及与临床病理特征的关系
   
　　RECK和MMP2在不同性别、不同病理类型及不同发生部位的OS组织中的阳性表达率比较差异无显著性(P>0.05)；RECK和MMP2在与ENNEKING外科分期及有无肺转移的OS组织中的阳性表达率比较差异有显著性(χ2=5.56～11.29,P<0.05)。见表2。表2  RECK及MMP2在骨肉瘤组织表达及与临床病理特征的关系（略）

　　2.3  RECK及MMP2的相关性分析
   
　　OS组织中RECK与MMP2的表达呈负相关(r=-0.84，P<0.05)。见表3。表3  RECK及MMP2在OS组织中表达的相关性（略）

　　3  讨论

　　OS是儿童和青少年最常见的恶性肿瘤之一，其恶性程度高，早期转移（尤其是肺转移）是影响病人治愈率提高的主要因素。因此，探讨OS的转移机制和影响因素对治疗本病及提高病人生存率具有重要的意义。本文分别检测了RECK及MMP2在OS组织中的表达情况，以探讨两者在OS发展及转移中的意义。
   
　　基底膜和细胞外基质(ECM)是阻止肿瘤侵袭和转移的主要屏障,肿瘤的侵袭和转移首要条件就是应具备降解细胞外基质和基底膜的能力,这一过程涉及大量的蛋白酶及其抑制剂,其中基质金属蛋白酶（MMPs）家族是基底膜降解过程中必不可少的酶,几乎能降解ECM中所有的成分和基底膜的胶原,促使肿瘤细胞侵袭周边结缔组织并进入脉管系统,最后到达其他组织器官。MMPs是自然界进化中高度保守的一类酶, 由20多个锌依赖性内肽酶组成，广泛分布于植物、脊椎动物、无脊椎动物中,分子大小各异,有一定的底物特异性，是影响肿瘤侵袭和转移的关键酶。根据底物的不同,主要分为以下几类[7]:胶原酶、明胶酶、基质溶解素、膜型基质金属蛋白酶及其他类型。有研究结果表明,MMPs过度表达与肿瘤的恶性程度密切相关[78]。
   
　　RECK基因是1998年发现的一种新基因,其在正常组织中高表达,而在各种肿瘤来源的细胞系及转染了ras等癌基因的细胞中低表达[3,9]。此外基因敲除研究发现,RECK基因还与血管生成密切相关,其适量表达能抑制血管的生成[1012]。目前研究结果表明,RECK基因能在转录后水平抑制至少3种MMP，即MMP2、MMP9及MT1MMP,进而抑制肿瘤的血管形成及转移[1012]。具体作用表现为膜表面锚定的RECK基因抑制MMP9前体的分泌,而锚定的RECK蛋白及可溶性RECK蛋白均可抑制MMP2、MMP9及MT1MMP的活性。
   
　　本实验结果显示,RECK蛋白在OS组织中的表达明显低于在骨软骨瘤组织中的表达，两组间差异有显著性；OS组中存在肺转移的组织RECK表达率明显低于无肺转移的组织表达率，两组间差异有显著性,即RECK在OS组织中低表达,并随肿瘤浸润及远处转移的发生而降低，与KANG等[13]报道的结果相符，提示RECK基因表达的缺失与OS的发生、发展、浸润和转移密切相关,而且可能为判断OS恶性程度提供依据。MMP2在OS组织中的表达明显高于在骨软骨瘤组织中的表达,两组间差异有显著性,其在OS存在肺转移的组织中表达率又明显高于无肺转移的组织表达率，两组间差异有显著性,即MMP2在OS组织中高表达,并随肿瘤浸润及远处转移的发生而增高。
   
　　本实验结果同时显示，RECK和MMP2在OS组织中的表达呈负相关。MMP2的表达随RECK的降低而升高,提示OS组织中RECK表达的缺失导致了对MMP2的抑制作用降低,而使MMP2高表达,进而促进了肿瘤细胞的侵袭和转移。
   
　　总之,RECK和MMP2的异常表达可能在OS的发生、发展和浸润转移过程中起重要作用,有可能成为判断OS生物学行为的重要指标。但其具体机制和途径目前尚不清楚,需要进行更深入的研究。

【参考文献】
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　　[12]　WELM B, MOTT J, WERB Z. Developmental biology:vasculogenesis is a wreck without RECK[J]. Curr Biol, 2002,12(6):R209211.

　　[13]　KANG H G, KIM H S, KIM K J, et al. RECK expression in osteosarcoma:correlation with matrix metalloproteinases activation and tumor invasiveness[J]. J Orthop Res, 2007,25(5):696702.