重组质粒pVAX1-C3d-S 2 S的构建与序列分析及其在真核细胞中的初步表达

关键词 补体C3d preS ^2- S基因 pVAX1 乙肝核酸疫苗

The construction and the sequence analysing of the eukaryotic

expression plasmid pVAX1-C3d-S2S and the researching of it’s expression in the eukaryotic cells

Sun Meiqin，Jin Xiaolan，Jiang Dachun，et al.

Department of Vascular and Heart Diseases of Chengdu Army General Hospital，Chengdu610083.

【Abstract】 Objective The commplement C3d has a stronger postive role to control the immunologic system.We have utilized the vector of pVAX1admitted by FDA to construct the recombinant plasmid including the comple_ˉment C3d and hepatitis B preS2S antigen gene（adw2serum type），in order to enhance the inmmunologic efficiencies of the HBV nucleotic acid vaccine.And detecting it’s transient expression in the eukaryotic cells.Methods Amplify_ˉing the segment of complementC3d gene and the preS2-S gene of HBV by PCR;linking the two segment;and then inserting the linked segment of C3d-preS2-S into pVAX1;detecting the new plasmid pVAX1-C3d-S2S by diˉgesting with Eco RI and DNA sequencing.Finaly，exploring it’s transient expression by amplifying the segment S2S from the transfected eukaryotic cells SP2/0and detecting HBsAg by ELISA.Results The DNA sequencing confirmed the segment of the C3d，preS2-S and the whole pVAX1-C3d-S2S.Then we demonstrated HBsAg by ELISA and amplified preS2S gene from the transfected cells-SP2/0.Conclusion We have successfully cloned the gene of the complement C3d and the preS2S of adw2serum type of HBV;and constructed the recombinant plasmid of pVAX1-C3d-S2S.We also indicate that it can be expressed in the eukaryotic cells.

Key words complement C3d preS 2 S gene pVAX1 HBV nucleotic vaccine

国内外迄今为止的研究结果表明，现有的各种核酸疫苗普遍存在着免疫诱生效力偏低的问题，尚不能达到实用化的目的，这已经成为限制核酸疫苗实用化的“瓶颈” ^［1，2］ 。国内外学者已采用多种不同的方法来增强核酸疫苗的免疫诱生效力，如使用高效表达载体、增加分子佐剂、改变  接种方式等。而分子佐剂的研究近年来发展较快，文献报道，抗原与若干个C3d分子偶联成为融合蛋白，可增强该抗原的免疫原性^［3，4］ 。因此，补体分子C3d作为一种新型佐剂已引起人们的关注。为此，我们构建了含有补体C3d及preS ^2- S抗原编码基因的乙肝核酸疫苗重组质粒，验证补体C3d的佐剂效应，以期建立一种新型且具有较高表达效率并能诱生更强免疫应答的乙肝核酸疫苗，从而加快乙肝核酸疫苗的实用化进程。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 仪器及试剂 BALB/C小鼠均来自四川大学华西医院实验动物中心;PCR仪为Hangzhou Tarotoc Thermal cycter;PCR配套试剂和DNA ligation Kits购自日本TaRaKa公司;Total RNA Kit和pGEM T easy Vector试剂盒购自美国Promega公司;限制性核酸内切酶EcoRI、KpnI、NotI和T4连接酶、AMV逆转录酶及DNA回收试剂盒购自美国Omega公司;Plasmid Mini Prep Kit购自德国Qiagen公司;pVAX1载体由唐红博士惠赠;JM109由地奥集团惠赠;小鼠骨髓瘤细胞SP2/0由高小平研究员惠赠;HBsAg检测试剂盒购自华美生物工程公司。

1.1.2 PCR引物 根据Ross提供的C3d序列及Denbank上HBV基因序列，由笔者自行设计，上海基康生物技术有限公司合成，序列为

P 1 :5′GCG GGT ACC ATG GCC AAG GAG GCA GAT GTG TCA CTC ACA G3′

P 2 :5′ACC AGA ACC ACC ACC ACC AGA ACC ACC ACC ACC ATC CAC TGC TGG GGA GGT GG3′

P 3 :5′GGT TCT GGT GGT GGT GGT TCT GGT GGT GGT GGTTCT ATG CAG TGG AAC TCC ACA ACA TTC CAC3′

P 4 :5′AGC GGC CGC ATG TAT ACC CAA AGA CAA AAG AA3′黑体部分为添加的限制性核酸内切酶KpnI、NotI特异识别的核苷酸序列。

1.2 实验方法

1.2.1 目的基因的获取与连接 （1）扩增上游带Linker的C3d基因（C3d-约900bp）:引物使用P ₁ 、P ₂ ，PCR反应体系:pGEM-C3d质粒5μl、10×Buffer5μl、dNTP（2.5mmol/L）4μl、P ₁ （10μmol/L）1.25μl、P ₂ （10μmol/L）1.25μl、Deep vent poly_ˉmerase（0.5U/μl）2.5μl、H 2 O31μl，共计50μl。反应结束后，取PCR产物5μl，1%琼脂糖凝胶电泳，80V，约20min;在900bp附近观察到一清晰条带（C3d），继续制备1%琼脂糖分离胶，电泳后分离900bp的目标条带，切胶称重，按Qiagen胶回收试剂盒的说明书操作，分离纯化目的片段C3d，最后用50μl纯水洗脱备用。（2）扩增下游带linker的S 2 S基因（-S ₂ S约900bp）:引物使用P ₃ 、P ₄ ，PCR反应体系:HBV+血清5μl、10×Buffer5μl、dNTP（2.5mmol/l）4μl、P ₃ （10μmol/L）1.25μl、P ₄ （10μmol/L）1.25μl、pyrobest polymerase（0.5U/μl）2.5μl、H ₂ O31μl，共计50μl。短暂离心后置于PCR仪上扩增。反应结束后，取PCR产物5μl，1%琼脂糖凝胶电泳，80V，约20min;若在900bp附近观察到一清晰条带（S₂ S），后再制备1%琼脂糖分离胶，电泳后分离约900bp的目标条带，切胶称重，按Qiagen胶回收试剂盒的说明书操作，分离纯化目的片段S ₂ S，最后用50μl纯水洗脱备用。（3）连接“C3d-”和“-S ₂ S”，组成C3d-S ₂ S