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关键词 特发性血小板减少性紫癜 Th1，Th2细胞 CD54 CD28 CD45 强的松
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115（2004）07-0580-03
Study on the Th1，Th2and the expression of part of the lymphocytes of the patients with CITP
Mao Liang，Quyang Jian，Chen Junhao
The Affiliated Gulou Hospital，Medical College of Nanjing University，Jiangsu210008.
【Abstract】 Objective To investigate the level of T-helper l（Th1），T-helper2（Th2）and the expression of CD54，CD28，CD45in the peripheral blood lymphocytes from the patients with chronic idiopathic thrombocytopenic purpura（CITP）post prednisone treatment.Methods Use flow cytometry to measure the expression of CD54，CD28，CD45and the level of Th1，Th2in the peripheral blood lymphocytes from10patients with CITP.Results The rates of Th1cells were significantly decreased in the patients（P<0.01）.The rates of CD54 + lymphocyte and CD8 + CD28 + T cell（CTL）was significantly higher（P<0.05）respectively in the patients.The rates of Th2and CD45RO + ，CD45RA + ，CD45RO + CD45RA + lymphocytes did not differ between patients and health controls.Conclusion Our studies indicates that in the patients of CITP post prednisone treatment:（1）the rates of Th1，Th2is still abnormal;（2）the high rates of CD54 + lymphocytes and the high rates of CTL may suggest CTL may be still abnormally activated.
Key words chronic idiopathic thrombocytopenic purpura（CITP） Th1Th2 CD54 CD28 CD45 predˉnisone
特发性血小板减少性紫癜（ITP）是一种较常见的免疫性出血性疾病，以自身抗体介导的血小板的破坏与清除为特征。已知ITP的发生不仅与体液免疫异常有关，细胞免疫功能的失调亦是重要方面，且近年来的研究表明，ITP病人体内细胞因子处于异常水平，某些细胞因子与ITP的发病及其临床进展有关 ［1］ 。本实验通过检测强的松治疗后患者外周血T淋巴细胞Th亚群、淋巴细胞表面标志CD54、CD28、CD45的表达情况，进一步研究强的松治疗后ITP患者体内的免疫异常情况。
1 对象和方法
1.1 对象
1.1.1 病例组 慢性ITP患者10例（13～66岁），男5例，女5例。诊断及疗效标准按全国第二届血液学学术会议拟定的标准 ［2］ 。均采用强的松治疗。患者的一般情况、标本采集时的血小板计数及强的松用量，见表1。
表1 患者的一般情况、标本采集时的血小板计数及强的松用量略
1.1.2 对照组 6例（23～50岁），均为健康成人，男3例，女3例。
1.2 方法
1.2.1 主要试剂、仪器 CD3-PC5，CD8-FITC，FixA，FixB，PE标记的IFN-γ，PE标记的IL-4均为CALTAG公司产品。莫能霉素（monensin），离子霉素（ionomycin），PMA均为SIGMA公司产品。流式细胞仪，FACSCalibur，BD公司。
1.2.2 T淋巴细胞Th1/Th2亚群检测方法 取空腹静脉血1ml，灭菌肝素抗凝，于试管中加入100μl血及100μl RPMI1640完全培养基，加入5μl1μg/ml PMA，3.4μl1mg/ml monˉensin，4μl50μg/ml ionomycin。置于37℃，5%的CO 2 孵箱内培养4h。混匀，取出100μl，加入5μl CD3-PC5，5μl CD8-FITC，避光染色15min。加入FixA液，避光染色15min。用1ml生理盐水洗涤，1200r/min，离心5min。弃上清液，加入100μl FixB液混匀，各取50μl分为两管。一管加入5μl IFN-γ，一管加入5μl IL-4，避光染色30min。用1ml生理盐水洗涤，
1200转/min离心5min，弃上清液。重复一次。最后用0.25ml生理盐水定容，上机检测。
1.2.3 淋巴细胞表面标志CD54，CD28，CD45检测方法 于各试管中加入10μl相应单抗，50μl血液，避光染色15min。各试管中加入溶血素2ml，避光染色10min。用1ml生理盐水洗涤，1500r/min，离心5min，弃上清液。重复一次。最后用0.25ml生理盐水定容，上机检测。
1.3 统计学方法 用SAS软件行两样本均数比较（方差齐 用t检验，方差不齐用t′检验）。
2 结果
强的松治疗后:ITP患者体内淋巴细胞Th1群显著少于正常对照组，差异有非常显著性（P<0.01），但Th2亚群与正常组差异无显著性（P>0.05），ITP组淋巴细胞表面CD54表达高于正常对照组，差异有显著性（P<0.05），ITP组CD4 + CD28 - 及CD8 + CD28 + T细胞数量高于正常对照组，差异有显著性（P<0.05），ITP组与对照组淋巴细胞表面CD45RO + ，CD45RA + ，CD45RO + CD45RA + 表达情况差异无显著性（P>0.05），分别见表2～5。
表2 正常组与ITP组Th1，Th2亚群的测定结果 （略）
表3 正常组与ITP组淋巴细胞表面CD54的表达情况 （略）
表4 正常组与ITP组淋巴细胞表面CD4 + CD28 - ，CD4 + CD28 + ，CD8 + CD28 - ，CD8 + CD28 + 表达情况 （略）
表5 正常组与ITP组淋巴细胞表面CD45RO + ，CD45RA + ，CD45RO + CD45RA + 的表达情况 （略）
3 讨论
既往的研究显示，若Th细胞具有明显的Th1分化倾向易导致器官特异性的自身免疫性疾病，而Th2类因子则能起到保护作用 ［3］ 。John W.Sepmpl等报道慢性ITP患者血清中IL-2和IFN-γ水平均显著高于正常对照组 ［4］ ，差异有非常显著性（P<0.01），表明初发而未经治疗的慢性ITP患者Th细胞具有明显的Th1分化倾向，Th1细胞占优势 ［5］ 。但Athanasia Mouzaki等报道慢性ITP患者初发时IFN-γ水平持续在高位，而在IVIg治疗后则出现IFN-γ表达的迅速下降，并且使这部分病人获得长期缓解，说明治疗有效的慢性ITP患者体内Th0细胞的Th1分化倾向被抑制，Th1细胞数量下调 ［6］ 。本实验中强的松治疗有效的慢性ITP患者体内T辅助细胞中Th1亚群少于正常对照组，且两者差异有非常显著性（P<0.01），提示强的松治疗有效的患者体内Th1细胞数量下调。但本实验中ITP患者强的松治疗前未行Th1，Th2亚群测定，故强的松治疗后患者体内Th1亚群 低于正常对照组是否与强的松治疗有关尚待进一步研究证实。本实验中ITP组CD8 + CD28 + T（细胞毒性T细胞/CTL）细胞数量高于正常对照组且差异有非常显著性，且本实验中ITP组淋巴细胞表面表达CD54分子数量大于正常对照组，并且差异有非常显著性（P<0.01），故我们推测由于CTL与靶细胞的最初接触需依靠粘附分子（如CD54）的作用，且CTL细胞活化后亦可反馈增强粘附分子的表达，从而更利于其自身发挥杀伤作用。故强的松治疗后的ITP患者体内仍存在细胞毒性T细胞异常激活的情况。这种异常是否为治疗前病理状态的延续及将持续多长时间尚待进一步研究。CD45通过对蛋白酪氨酸激酶（PTKs）的调节，在淋巴细胞的发育和活化中起重要作用 ［7］ 。如Ulyanova T等研究显示，缺乏CD45的CD4 + 、CD8 + T细胞，其抗原特异性增殖能力、分泌IFN-γ能力以及溶解靶细胞能力均降低 ［8］ 。但Irie Sasaki等的研究发现，CD45对细胞因子受体介导的信号传导起负性调节作用，并且发现破坏CD45基因则可以增强细胞因子和IFN-γ受体介导的细胞活化 ［9］ 。虽然详细机制尚不清楚，但至少有一点可以肯定，就是CD45在细胞因子受体介导的信号传导中起关键的调节作用，而且这种调节作用是非常复杂的。本实验中ITP组与对照组淋巴细胞表面CD45RO + ，CD45RA + ，CD45RA + CD45RA + 表达的
数量差异并无显著性（P>0.05），似乎提示强的松治疗有效的慢性ITP患者体内CD45在信号转导中的调节作用并无明显异常。这一现象是否与强的松治疗有效有关尚待进一步研究证实。
回顾全文，本实验检测了强的松治疗有效的慢性ITP患者外周血T淋巴细胞Th1，Th2亚群，证明强的松治疗后的ITP患者们仍存在T辅助细胞Th1，Th2亚群功能异常。粘附分子CD54在淋巴细胞表面高表达，CD8 + CD28 + T细胞（细胞毒性T细胞）增多，提示强的松治疗后的ITP患者体内仍存在细胞毒性T细胞功能亢进的情况。
参考文献
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作者单位:210008南京大学医学院附属鼓楼医院
（收稿日期:2003-11-22） （编辑李 阳）