点击显示 收起
mice and hematopoietic cell proliferation in recipients
Li Xingya，Shen Shujing，Jiang Xi.
Department of Oncology，the First Affiliated Hospital，Zhenzhou University，Zhengzhou450052.
【Abstract】 Objective To explore optimal protocol for total body irradiation（TBI）for allogenenic bone marˉrow transplantation in mice.Methods BALB/c（H-2 d ）mice were exposed to two irradiation regimens:a single TBI9.0Gy or fractionated total body irradiation（FTBI）5.5Gy×2with a4h interval on the day before allogenic BMT.Those mice were intravenously injected with2×10 6 ，5×10 6 ，1×10 7 or2×10 7 C57BL/6J bone marrow cells24h after irradiation.Results The survival rates of mice got BMT4or24hours after a single9.0Gy TBI were6/12and7/12respectively.The survival rates of mice got a single dose9.0Gy TBI or5.5Gy×2FTBI were13/32and28/32reˉspectively.Most mice got2×10 6 cell transplantation died within one week after BMT，the survival rate was much lowˉer than those had5×10 6 or more bone marrow cell injected.There were more mice drinking water containing genˉtamycin survived after BMT than those drinking ordinary acidified water.Conclusion TBI conditioning regimen and the amount of bone marrow cell transplant
ed are important factors that influence allogeneic BMT survival.
Key words bone marrow transplantation allogene hematopoietic cell mice
异基因骨髓移植（allo-BMT）广泛用于治疗小鼠白血病、实体瘤、系统性以及器官特异性自身免疫性疾病的试验研究，也用于治疗再生障碍性贫血、先天性免疫缺陷性疾病、代谢性疾病等 ［1～3］ 。虽然BALB/c是一种极为常用的小鼠，但很少用作骨髓移植的受体，因为这种小鼠对同位素照射比较敏感，不能耐受适用于大多数小鼠的预处理条件，经一次性9.0Gy同位素照射会有半数以上在4～10天内死亡。我们在实验中不断观察预处理方案、移植时间、骨髓细胞移植数量、移植途径（经尾静脉、眶后静脉窦、门静脉）和鼠龄等因素对移植后生存率的影响，发现照射的剂量和方案以及骨髓细胞移植数量是影响存活率的主要因素。
1 材料和方法
1.1 实验动物 近交系BALB/c（H-2 d ）和C57BL/6J（H-2 b ）小鼠;8～10周龄，体重20g左右，雌性，均由CR-NCI提供。以MHC-I类抗原为促进子的绿色荧光蛋白（GFP）C57BL/6J（H-2 b ）小鼠由Dr.T.V.Rajan实验室提供。所有小鼠在康州大学健康中心的动物中心饲养。
1.2 同位素照射 照射设备为Atonomic Energy of Canada Limited公司生产的Gammacell40照射机，所用放射源为 137 Cs，其剂量率为69cGy/min。
根据照射方案分为两大组:（1）TBI组:TBI1次9.0Gy;（2）FTBI组:5.5GyTBI2次间隔4h共11Gy。每组32只。
1.3 骨髓细胞制备 鼠颈椎脱位法处死后依次在2%碘酒和75%的乙醇中浸泡3～5min，无菌条件下剥离股骨及胫骨，剪去两端，用RPMI-1640培养液冲出骨髓，制成细胞悬液，洗涤并计数。调整细胞浓度为2×10 7 /ml备用。
1.4 骨髓移植与分组
1.4.1 照射剂量和移植的骨髓细胞数量对存活率的影响 （1）TBI组:32只BALB/c小鼠1次TBI9.0Gy，24h后BMT，依移植的骨髓细胞数分为4个亚组:A1组:2×10 6 ，B1组:5×10 6 ;C1组:1×10 7 ;D1组:2×10 7 。每亚组8只。（2）5.5Gy×2组:32只BALB/c小鼠5.5Gy TBI2次间隔4h，根据移植的骨髓细胞数又分4个亚组:A2组:2×10 6 ，B2组:5×10 6 ;C2组:1×10 7 ;D2组:2×10 7 。每亚组8只。小鼠TBI前1天开始饮用含200mg/L庆大霉素的酸化水，连续2周。
1.4.2 庆大霉素饲喂与否对存活率的影响 24只Balb/c小鼠，5.5Gy×2TBI后24h经尾静脉注射1×10 7 个C57BL/6骨髓细胞，平均分为2组，A组12只在TBI前1天开始饮用含200mg/L庆大霉素酸化水，连续2周，B组12只饮用普通的酸化水。
1.5 观察一般状况和死亡时间 移植后每日观察小鼠进食及精神状况，有无弓背、翘毛、脱毛、腹泻等表现。定期称量体重，记录每只小鼠的存活时间并计算存活率。在移植后2周内出现的造血抑制所致感染、出血等原因引起的死亡均界定为移植相关死亡。各组小鼠的观察期为60天。1.6 统计学方法 存活率的比较用χ 2 检验，显著性水准α=0.05。
2 结果
2.1 照射剂量和移植的骨髓细胞数量对存活率的影响 如表1所示，接受2×10 6 骨髓细胞移植的A1亚组8只全部死亡，存活率明显低于B1、C1和D1亚组和9.0Gy照射组的存活率，差异有显著性（P<0.05）;B1，C1和D1亚组的存活率接近，差异无显著性。
表1 9.0Gy TBI后不同数量骨髓细胞BMT小鼠存活率组别 略
如表2所示，2×10 6 骨髓细胞移植的A2组存活率最低，为50%（4/8），与C2、D2亚组和5.5Gy×2组的差异均有显著性（P<0.05）。B2，C2和D2各亚组之间差异无显著性。 比较表1和表2可以看出，9.0Gy和5.5Gy×2两个大组的总存活率分别是13/32和28/32，差异有显著性（P=0.000）;5.5Gy×2各个亚组的存活率均高于相应的9.0Gy的亚组，其中A1组与A2组及D1组与D2组相比，差异都有显著性（P=0.021）。2×10 6 个骨髓细胞的异基因骨髓移植的小鼠存活率明显低于5×10 6 以上。
表2 5.5Gy×2TBI后不同数量骨髓细胞BMT小鼠存活率略
2.2 庆大霉素饲喂与否对存活率的影响 A组连续饮用含庆大霉素酸化水，B组饮用普通的酸化水。A、B两组的存活率分别12/12和9/12，前者高于后者，差异未达到显著水准（P=0.064）。
3 讨论
骨髓移植（BMT）已成为治疗血液系统疾病（白血病、再生障碍性贫血等）、先天性免疫缺陷性疾病、代谢性疾病和自身免疫性疾病的有效方法之一。在动物实验研究中，BMT除了用于治疗小鼠白血病和实体瘤，也有研究者用BMT治疗小鼠红斑狼疮、类风湿性关节炎、免疫性血小板减少性紫癜和胰岛素依赖型糖尿病等自身免疫性疾病模型都取得了较好的疗效 ［1，2］ 。不同的移植前预处理方案和骨髓细胞注射途径（静脉、门静脉或骨髓腔内）都能影响移植后存活率、移植成功率和移植物抗宿主疾病（GVHD）发病率 ［1～3］ 。尽管BALB/c是极为常用的纯系实验小鼠，但很少用作同骨髓移植的受者，一般认为BALB/c对射线过于敏感，一次照射不能超过8.0Gy ［2］ 。我们在小鼠骨髓移植研究中发现，用CD1小鼠进行骨髓移植时，一次性9.0GyTBI后经静脉注射2×10 6 骨髓细胞，在近100只接受骨髓移植的小鼠CD1中无一死亡。而用BALB/c小鼠作骨髓移植实验时，一次性9.0GyTBI后2×10 6 骨髓细胞同基因或异基因BMT，30余只几乎全部死亡。增加移植的骨髓细胞数量能使BALB/c的存活率提高到50%左右。死亡多发生在照射后4～8天，死前小鼠腹泻、萎靡、不活动和体温下降等，部分小鼠有明显的软组织感染的表现。如何提高BALB/c骨髓移植的存活率是本文研究的重点，笔者从改变预处理方案、照射后骨髓细胞移植数量及减轻肠道感染等方面进行了尝试，发现分割全身照射由于一次性大剂量TBI，移植的骨髓细胞数量不得少于5×10 6 。
我们在以绿色荧光蛋白转基因的GFP-C57BL/6J（H-2 b ）小鼠为供体、BALB/c（H-2 d ）为受体的骨髓移植研究中，用GFP-C57BL/6J作为移植供体，是把绿荧光作为骨髓细胞在受体内的归巢和增殖的示踪剂，发现供体造血细胞在脾脏和骨髓内增殖较快，在胸腺组织内的增殖相对较慢，3周后达到95%。血液和淋巴结内GFP荧光细胞增殖相对缓慢，5周后达到85%左右。移植后3天可在小肠肠壁发现绿荧光细胞，之后肠道集合淋巴结体积增大并见大量绿荧光细胞，与移植后3周见脾脏体积明显肿大并在其表面和切面见大量增殖结节，一度极度萎缩的胸腺体积与对照组相比也明显增大。
在移植后的第3天，即能够在骨髓、周围血和肠壁发现少量的异基因供体绿荧光细胞，而此时在其他组织难以见到供体细胞，1周后在小肠集合淋巴结、肠壁绒毛出现大量供体细胞，提示肠道是骨髓移植后造血干细胞优先定居、增殖与分化的部位之一。照射后的腹泻是肠道的急性放射性损伤，骨髓移植后的早期机体的的免疫防御能力正处于低谷，从而造成严重的肠道感染。损伤感染的肠道不能为宿主提供造血干细胞定居、增殖的场所，免疫重建的延迟又影响肠道感染的控制和损伤的修复，造成恶性循环。所以如何减轻放射性肠粘膜损伤是骨髓移植预处理中的关键之一。本研究把一次性9.0Gy同位素照射改为2次分割放疗后能够明显减轻放射后对机体，特别是对肠粘膜的损伤，饮水中加用抗菌药物能减轻放射后肠道的细菌感染，保护了供体骨髓定居增殖的“土壤”。
尽管用于移植的C57BL/6J骨髓细胞没有去除T细胞，异基因骨髓移植的Balb/c小鼠在60天的观察期内也很少有小鼠出现GVHD，如果静脉输注供体淋巴细胞，才会引发GVHD。而Balb/c为供体、C57BL/6J为受体的异基因骨髓移植小鼠则多有发生明显的GVHD。造成这种差异的原因目前还不清楚，可能是Balb/c的免疫细胞对射线更为敏感所致。目前日本学者致力于研究骨髓内注射供体骨髓细胞，认为这种移植方法的成功率更高，引起GVHD发病率明 显降低，已经成为这一领域研究的一个热点 ［3～5］ 。
参考文献
1 Slavin S，Morecki S，Weiss L，et al.Immunotherapy of hematoˉlogic malignancies and metastatic solid tumors in experimental animals and man.Critical Reviews in Oncology/Hematology，2003May，46（2）:139-163.
2 Ikehara S.Treatment of autoimmune diseases by hematopoitic stem cell transplantation.Exp Hematol，2001，29:661-669.
3 Cui YZ，Hisha H，Yang GX，et al.Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice.Bone marrow transplantation，2002，30:843-849.
4 Nakamura K，Inaba M，Sugiura K，et al.Enhancement of alloˉgeneic hematopoietic stem cell engraftment and prevention of GVHD by intra-bone marrow bone marrow transplantation plus donor lymphocyte infusion.Stem Cells，2004，22:125-134.
5 Ikehara S.Anomel strategy for allogeneic stem cell transplantaˉtion:perfusion method plus intra-bone marrow injection of sem cells.Experimental Hematology，2003，31:1142-1146.
作者单位:1 450052郑州大学第一附属医院肿瘤科
2 450003郑州河南省肿瘤医院内科
3 06030美国康涅狄格州大学健康中心遗传发育生物系
（收稿日期:2004-04-08） （编辑李 木）