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关键词 艾滋病毒 核酸检测
Development of HIV nucleic acid assays
Wang Hong，He Shaorong，Mo Zhihong
College of Chemistry and Chemical Engineering，Chongqing University，Chongqing400044.
【Abstract】 Quantitation of HIV nucleic acid（Viral Load）has become the major prognostic marker for disease prognosis and outcome of antiretroviral therapy in the treatment of HIV-infected individuals.The three major methodˉologies for viral load quantitation:the reverse transcriptase-polymerase chain reaction（RT-PCR;Amplicor trade mark HIV-1Monitor Test，Roche Diagnostic Systems，Pleasanton，CA），the nucleic acid sequence-based amplificaˉtion（NASBA;NucliSens trade mark HIV-1QTTest，Organon Teknika，Bostel，The Netherlands）;and a signal ampliˉfication methodology termed branched chain DNA（bDNA）technique（Quantiplex trade mark HIV-1RNA test，Bayer Diagnostics，Emeryville，CA）are briefly reviewed here.
Key words HIV nucleic acid assay
艾滋病（AIDS）是一种由艾滋病病毒、即人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，简称HIV）侵入人体后破坏人体免疫功能，使人体发生多种不可治愈的感染和肿瘤，最后导致被感染者死亡的一种严重传染病 ［1］ 。艾滋病毒的检测是艾滋病的预防和治疗的前提，目前艾滋病检测中最常用的方法是简单经济的酶联免疫吸附试验（ELISA）法，但是由于一般HIV抗体在人感染HIV后需2～3个月才出现，此前通常不能在感染者体内检出HIV抗体，也就是说存在一个“窗口期”的问题，因而具有局限性 ［2］ 。近年来，随着分子生物学技术的发展，出现了多种HIV核酸检测方法，能对HIV进行病毒载量测定，正成为检测病毒感染、评价病情进展和探讨发病机理以及疾病治疗的重要工具，本 文将主要描述HIV病毒的核酸检测方法。
1 HIV病毒核酸检测方法
近年来随着分子生物学的飞速发展以及生物物理技术的大量应用，各种核酸扩增检测方法不断涌现。已经建立起来的方法HIV RNA检测技术大体可分为两大类，靶核酸的直接扩增与信号放大扩增。前者包括聚合酶链式反应（PCR）、转录依赖扩增（TMA）和核酸序列扩增系统（NASBA）等，这些方法都具有很高的灵敏度。信号放大扩增技术主要有支链DNA信号扩大系统（bDNA）。目前已获美国食品与药品管理局（FDA）认可临床使用的HIV-1核酸检测方法列于表1 ［2］ 。这里对前三种应用最为广泛的HIV-1核酸检测方法予以介绍和评述。表1 获美国FDA许可临床使用的HIV-1核酸检测方法 ［2］
2 检测方法原理
2.1 RT-PCR检测法 见图1。该检测是基于对HIV-1 靶核酸RNA逆转录（RT），然后对其产物cDNA进行PCR扩增 ［3］ 。如图2所示，采用既有逆转录活性又有DNA聚合酶活性的热稳定重组酶Thermus thermophilusrTth）DNA聚合酶，使逆转录和PCR扩增一步完成。在包括对HIV-1gag基因保守区特异的寡核苷酸引物（生物素标记）、rTth聚合酶、三磷酸脱氧核苷的缓冲液中，病毒的cDNA片段通过加热冷却重复循环产生高拷贝数的扩增产物（Amplicon）。在包被HIV寡核苷酸探针的微孔板里，使Amplicons变性、杂交，加入抗生物素-辣根过氧化物酶（HRP）偶联物，与生物
素标记的Amplicon结合，最后加入HRP底物比色测定结合 的Amplicon量。另外，该方法在样本提取RNA前加入一已知浓度的内标（IS），同时起着样本HIV-1RNA定量和补偿血浆中影响核酸提取和抑制扩增因子的作用。IS含有与Amplicon大小和引物结合区相同的体外转录RNA，它产生的Amplicon也结合在微孔板里，并用一酶联检测体系产生比色信号，使其与靶基因的Amplicon区分开。测定OD值，比较病毒核酸孔与QS孔的OD值，通过计算可定量病毒的拷贝数。 图1 RT-PCR检测方法原理示意图图2 NASBA扩增示意图 RT-PCR系统主要为Roche Diagnostic System生产的AMPLICOR HIV-1MONITOR Assay。
目前已推出的试剂有1.0版本和升级版本1.5版本。此试剂也有普通敏感方法和超敏感方法两种。该系统的优点在于（1）敏感:1.5版标准型检测范围200～3000000拷贝/ml，超敏感型20～75000拷贝/ml。（2）操作相对简单:一个工作人员手动操作可完成42份/天，若使用其全自动Cobas系统则可更为轻松完成。（3）对大部分M组亚型有较好的敏感性。（4）对多数生物样品反应性良好。缺点在于（1）操作容易污染;（2）测定范围较小（相对于NASBA）;（3）部分生物样品反应受抑制，如精液、乳汁和唾液;（4）早期版本对部分亚型反应性较差，1.
0版对非B亚型的样品反应性普遍较差;（5）对O亚 型检测能力较差。
2.2 NASBA检测法 NASBA扩增机制可以分为非循环和循环两个阶段 ［4］ 。它由三个酶在一个体系里连续反应，野生型HIV-1RNA与三种内标RNA同时扩增:反转录酶在一个5′端常有T 7 RNA聚合酶启动子序列的引物引导下，把目标RNA序列反转录成单链DNA，然后由Rnase H把DNA/RNA杂合双链的RNA降解，再由反转录酶在另一引物引导下合成双链DNA。DNA可在T 7 RNA聚合酶的作用下，经其启动子序列起动而转录RNA。随着RNA的合成反应进入等温循环。RNA又可在反转录酶的作用下反转录成DNA。扩增后的产物使用NASBA QR电化学发光（ECL）系统进行检测和定量，此系统包括亲和素标记的磁珠、生物素标记的核苷酸片段（此片段可与新合成的RNA产物的一端互补结合）及可特异与四种产物结合的探针（探针上标记有铷元素），这四种探针可分别与不同的RNA产物结合。将四种探针分别置于不同的反应管内，在适当的条件下（41℃）几种成分将结合在一起，形成复合体。这些复合体可在ECL读数仪中被分别读取其上铷元素的激发信号，根据野生型病毒核酸测定值与其他三个内标物测定值的比较可得到野生型病毒的拷贝数。该过程可用图2简单表示 ［5］ 。
NASBA技术为Organon Teknika公司专利技术，早期产品为NASBA HIV-1RNA QT定量RNA测定方法，现已被最新版本的方法NucliSens HIV-RNA QT Assay取代。方法也分为普通敏感度和超敏感度两种。该方法的优点是（1）测定范围大:40～10，000，000c/ml;（2）可对几乎所有生物样品进行检测;（3）敏感:最低检测限可达40拷贝/ml;（4）对各种抗凝剂均适用;（5）每个样品均有内部对照，可排除提取过程的误差。缺点在于:（1）早期版本（NASBA）对部分亚型（G亚型）反应性差。（2）操作复杂，样品提取（不使用自动提取仪时）和测定反
应时需要进行大量的手工操作。（3）不适合一次大量检测，ECL读数仪每次只能进行12个样品的检测。（4）实验内、外误差相对较大。
2.3 bDNA检测法 如图3所示，将HIV的RNA通过离心在蛋白酶K的作用下通过孵化从病毒颗粒中释放出来，然后用捕获探针1将其捕获到微孔中。用捕获探针2与病毒RNA的另一部分特异结合，又与预放大探针结合。后者再 与放大探针即bDNA探针杂交。两套靶探针分别与病毒 RNA的pol基因的不同区域特异结合。就在微孔中形成了HIV RNA-寡核苷酸复合物。再加入一种化学发光底物孵育后产生化学发光信号，由于发光强度与样品中HIV RNA含量成正比，从而达到对HIV RNA的定量检测 ［6］ 。图3 bDNA方法示意图 本方法定量系统中没有内标记物，每次实验设置一系列外部标记，通过实验样品反应强度与外部标记样品强度的比较确定实验样品的病毒拷贝数。分支DNA（bDNA）原为Chiron Diagnostics专利技术，现已被拜尔（BYER）公司合并。早期的试剂为Quantiplex HIV RNA2.0Assay，现已被Quantiplex HIV RNA3.0Assay取代。该方法的优点是:（1）操作简便，尤其是在使用自动检测系统时。（2）适合大量样品的操作，3.0版可每次操作多达168份样品。（3）重复性好。（4）敏感性较好。缺点是:（1）对低值样品检测的特异性较差。（2）无内部质量控制，尤其在3.0版中为单孔检测时，无法控制由于提取或加样操作的失误。（3）不同版本间差异较大，2.0版约为RT-PCR的50%，3.0版结果与Roche基本相同表明两个版本间差异可能达到50%。（4） 对除血浆、血清外的大部分体液样品无法进行检测。（5）对 抗凝剂敏感，只能使用EDTA ［7］ 。
3 三种检测方法分析性能及其对比
有关AMPLICOR HIV-1MONITOR、NucliSens HIV-1QT和Versant HIV-1RNA3.0三种方法用于HIV-1核酸检测的性能对比研究已有许多报道 ［8～15］ ，各种方法的分析性能及其对比如表2所示。由表可见，三种方法中以NASBA法检测最为灵敏，并有极宽的检测范围。上述方法两两对照研究表明，在检测范围内均有较好的相关