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Cheng Shanhong，Wang Lu
Beijing University，Beijing100083.
【Abstract】 Objective To investigate the gene evolution of human CKLFSF1and provide a basis for the aniˉmal experimental research of it，this article conducted the experiment of cloning of mouse Cklfsf1cDNA.Methods Clone Cklfsf1using bioinformatics tools，PCR and DNA sequencing etc，and analyze the expression pattern of Cklfsf1in normal tissues and specific cells of testis of mouse using RT-PCR，Northern blot and LCM.Results Successfully cloned the coding sequence of Cklfsf1and identified three alternative spliced isoforms the sequences of which were deˉposited in GenBank and were named Cklfsf1 — v1，v2and v3，respectively.According to the BlastP program，the identiˉties of Cklfsf1 - v1，v2and v3with CKLFSF1 — v17at the amino acid level are16/35，no significant similarity and58/145，respectively.Northern blot showed that it’s highly expressed in testis and undetectable in other tissues.RT-PCR results of LCM showed that it’s expressed in the primary and secondary spermatocyte.Conclusion Mouse Cklfsf1shares significant similarity with human CKLFSF1in such aspects as sequence，structure，chromosome localization and expression pattern etc，which shows that the evolution of human CKLFSF1can be at least traced back to mouse and mouse is an useful animal modal for the functional research of human CKLFSF1.
Key words chemokine-like factor super family alternative splicing testis
我们实验室利用抑制性减数杂交技术，克隆到一个具有CC特征性结构的新细胞因子-趋化素样因子（CKLF） ［1］ 。通过用tBlastN程序在人EST数据库中搜索与CKLF变异体2（全长）在氨基酸水平具有较高相似性的序列，又陆续克隆了8个与CKLF相关的新基因。经HUGO基因命名委员会同意，被命名为趋化素样因子超家族 ［2］（chemokine-like factor superfamily）。
CKLFSF1是第一个通过计算机克隆得到的趋化素样因子超家族成员，至少具有23个变异体。Northern Blot和RT-PCR结果均显示其在睾丸组织高表达，而在其它组织表达量甚微，免疫组化显示其在精母细胞、支持细胞和睾丸组织的组织液里高表达 ［3］ 。小鼠是研究人类基因的一个很好的动物模型，为了研究人趋化素样因子超家族成员1（CKLFSF1）的基因进化，并为其开展动物实验研究提供基础，我们选用小鼠作为研究CKLFSF1的
参照基因，希望通过对Cklfsf1的研究能够对CKLFSF1功能研究有所提示。
本文通过EST数据库搜索、生物信息学分析以及DNA测序克隆了Cklfsf1的3个变异体，通过cDNA序列和基因组序列比对分析了Cklfsf1的外显子组成，利用RT-PCR、Northern blot以及LCM等方法分析了Cklfsf1的正常组织表达谱以及睾丸组织不同细胞表达谱。
1 材料
XL1-Blue菌株系本室冻存。Balb/C小鼠购自北京大学医学部实验动物部。真核表达质粒pcDNA3.1/Myc-HisB（-）购自Invitrogen公司。pZero-T载体购自宝赛公司。DNA Ligation Kit购自TAKARA公司，Random Primed DNA Labeling Kit、Trizol试剂购自Invitrogen公司，寡核苷酸由北京赛百胜公司合成。
2 方法
2.1 计算机克隆 在美国基因组研究所TIGR网站，利用其小鼠基因索引（MGI）数据库，以CKLFSF1 — v17的核酸和氨基酸序列作为电子杂交探针，进行BLASTN、TBLASTN查询，得到EST片段，再将其进行拼接，得到全长cDNA序列。
2.2 引物的设计 根据计算机克隆全长cDNA序列设计PCR引物，5′引物位于最长开放读码框架ATG上游，序列为5′-GCCACCCAGCCGACCAG-3′，3′引物位于TGA下游，序列为5′-TCACAGTTACCACCGCCATAGG-3′。考虑到Cklfsf1与人CKLFSF1序列的相似，可能有不同的翻译起始位点 ［3］ ，因此设计了第2条5′引物，5′引物位于同一读码框架下游第2个ATG上游，序列为5′-GAGAAAGTGCCACˉCAACTCGAC-3′，3′引物同上。因为Cklfsf1的cDNA序列与Cklfsf2和Cklf的cDNA序列有部分重叠，为进行表达谱分析，又设计了一对比较特异的引物，5′引物序列为5′-TGTˉGTATTACGGCAACCTCAGTGT-3′，3′引物序列为5′-CCCCˉCTCCAGCGTAGCATA-3′。
2.3 睾丸cDNA文库的制备 6～8周Balb/C小鼠，颈椎脱臼处死，将睾丸组织取出，用Trizol试剂提取总RNA，方法按照Invitrogen公司说明，然后以oligo dT为引物逆转录合成cDNA。
2.4 Cklfsf1基因的克隆与序列测定 以睾丸cDNA文库为模板，使用以上设计的引物进行PCR扩增，PCR反应条件为:94℃变性5min，然后94℃30s、59℃30s、72℃30s循环35轮，72℃延伸7min。将PCR产物纯化后连接入pZero-T测序载体，连接产物转化Xl1-Blue感受态菌，最后挑单克隆、鉴定、测序。
2.5 生物信息学分析 将Cklfsf1全长和各变异体序列与小鼠基因组序列进行比对，分析Cklfsf1染色体定位和各变异体外显子的组成。将Cklfsf1各变异体氨基酸序列输入NCBI网站的保守性结构域搜索程序（conserved domain search）分析保守性结构域，输入TMHMM程序分析跨膜区域组成。
2.6 Cklfsf1的表达谱分析
2.6.1 睾丸组织不同细胞表达分析 6～8周小鼠颈椎脱臼处死，取出睾丸组织迅速置于液氮，使用LEICA冷冻切片机CM1900制作冷冻切片，切片厚度为5～7μm，冷冻切片制作好后迅速用70%乙醇固定30″，而后用DEPC水洗30″。随后用Mayer氏hematoxylin染色1′，DEPC水洗30″，经一系列酒精脱水，再用eosin Y染色1′，再经一系列酒精脱水，最后二甲苯透明。使用美国ARCUTUROUS公司的LCM系统LM200进行显微切割，方法按照公司的说明书。RNA提取以及cDNA第一链合成同上，最后用表达谱分析所用引物从文库里扩增Cklfsf1。
2.6.2 小鼠不同组织表达分析—Northern blot 总RNA提取方法同前。RNA凝胶变性电泳、印迹按照分子克隆第三版的方法。从测序载体里扩增探针DNA片段所用引物同上。使用Invitrogen公司的Random Primed DNA Labeling Kit标记探针。膜65℃预杂交4h，将探针95℃变性10min，立即冰浴1min后加于杂交袋，65℃过夜孵育，洗膜直到背景信号变弱，在磷感屏成像系统曝光。
3 结果
3.1 计算机克隆和测序 搜索TIGR的MGI得到一条cDˉNA序列（MGI登录号为TC888893），该cDNA全长1661bp，编码391个氨基酸。ATG起始的周边序列（CCCACCatgA），符合Kozak规律，ATG上游在同一读码框架上第7位密码子为终止密码子，在同一读码框Cklfsf1可能存在两个翻译起始位点（图1），但在其3′端没有发现典型的加尾信号。这是推测的Cklfsf1的全长序列，而实验中并没有得到这个全长序列。从睾丸cDNA文库PCR扩增Cklfsf1，鉴定得到3个变异体，分别命名为:Cklfsf1_v1，v2，v3，提交给GenBank，得到登录号分别为:AAQ73427（Cklfsf1 — v1）、AY241874（Cklfsf1 — v2）、AY241873（Cklfsf1 — v3）。Cklfsf1预测的全长由6个外显子组成，不同的变异体由不同外显子组成，Cklfsf1 — v1由外显子1B、1C、4A、5组成，编码220个氨基酸，v2由外显子1A、4A、5组成，编码264个氨基酸，v3由外显子1E、2、3、4、5组成，编码155个氨基酸组（图2）。Cklfsf1 — v1、v2、v3与CKLFSF1_v17在氨基酸水平的一致性根据BlastP程序分别为16/35、没有显著相似性、58/145。
3.2 生物信息学分析 小鼠Cklfsf1定位于8号染色体上，位于一个趋化素样因子超家族基因簇内，与Cklf和Cklfsf2紧密连锁。生物信息学分析发现，在结构域和跨膜区的组成上，不同变异体之间差别很大，Cklfsf1 — v1和v2缺少第2、3个外显子，提前出现终止码，所编码的蛋白是非跨膜蛋白。全长蛋白和v3具有潜在的4次跨膜结构域。全长蛋白C端及v3的N端含有一个典型的MARVEl结构域 ［5］ 。Cklfsf1 — v1和v2没有这个结构域，因为编码MARVEl结构域的序列主要存在于2、3外显子（图3）。分析各变异体及全长氨基酸序列组成发现v2和全长的N端为脯氨酸富含区域，而且含有多个PXXP基序 ［6］ ;v2比v1长26个氨基酸，正是这26个氨基酸含有多个PXXP基序。
3.3 Cklfsf1表达谱分析 睾丸组织不同细胞RT-PCR结果显示Cklfsf1表达于睾丸初级和次级精母细胞（图4）。Northern blot分析显示Cklfsf1在睾丸高表达，在其它组织没有检测到阳性信号;由于变异体比较复杂大小不一，Cklfsf1分子量大小在几百到一千多碱基之间，与预期的结果相符（图4）。（图1～图4见附页1～2）。
4 讨论
通过本文的小鼠Cklfsf1的cDNA克隆工作，我们首次实验验证了人CKLFSF1存在小鼠的同源基因，并且与人CKLFSF1多方面特征类似，包括在核酸与蛋白质序列上的同源性，染色体定位和连锁基因的类似性，存在MARVEL结构域和4次跨膜区，睾丸高表达等，这些结果表明人类CKLFSF1基因在进化上至少可以上溯到小鼠，可以利用小鼠模型研究CKLFSF1的功能。
在小鼠Cklfsf1基因的克隆和测序过程中，没有获得预测的全长序列，只获得了3个变异体。这可能是由于全长cDNA表达丰度比较低的缘故，也有可能各变异体的表达和睾丸的发育相关。如果用涵盖全长读码框架的引物去扩增，得到的2个变异体（Cklfsf1 — v1和v2）均提前出现了终止码，其编码的蛋白与人CKLFSF1相似性很低;用涵盖第2个ATG的5′引物去扩增，得到变异体Cklfsf1 — v3，其编码的蛋白与人CKLFSF1 — v17有很高相似性。我们推测Cklfsf1与人CKLFSF1相似，可能存在不同的转录起始位点，这需进一步实验证实。
从结构来看，Cklfsf1 — v1和v2由于提前出现了终止码，导致编码的蛋白缺乏跨膜区，亲水性较强。而Cklfsf1 — v3是四次跨膜蛋白，且含有一个典型的MARVEL结构域。所有含有MARVEL结构域的蛋白均为4次跨膜蛋白，其N端和C端在膜外，即所谓M形状的构型，这是与跨膜分析一致的。实验证实含有MARVEL结构域的蛋白可与富含胆固醇的膜微结构域结合 ［4］ 。Cklfsf1 — v2以及全长含有一个脯氨酸富含区域，且具有多个PXXP基序。PXXP是与SH3结构域结合的基序，SH3结构域通常与脯氨酸富含多肽结合，结合所需的最小一致序列为PXXP ［5］ 。SH3结构域通常存在于细胞骨架蛋白、膜结合蛋白以及信号转导通路蛋白，起到募集下游蛋白的功能 ［6］ 。综上所述，Cklfsf1 — v3可能与富含胆固醇的膜微结构域结合，Cklfsf1 — v2可能与含SH3结构域的蛋白结合，这些功能预测还需进一步的实验研究。RT-PCR和Northern blot分析显示Cklfsf1在睾丸组织高表达，LCM证明Cklfsf1表达于睾丸组织的初级和次级精母细胞。我们将表达Cklfsf1 — v3的真核表达质粒导入小鼠体内骨骼肌细胞后（资料未发表），发现其促进了睾丸曲细精管生精上皮精母细胞的减数分裂和精子细胞的生成。这些结果说明Cklfsf1是一个睾丸特异高表达基因，可能涉及精子生成过程。
综上所述，小鼠Cklfsf1的克隆成功为研究人的CKLFSF1提供了基础，并为Cklfsf1在小鼠动物模型中的功能研究提供了重要工具。
参考文献
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6 Mayer B.J.SH3domains:complexity in moderation.J.Cell Sci，2001，114:1253-1263.
（收稿日期:2004-06-08）
ˇ 基金项目:国家自然科学基金资助项目（编号:30070418）
作者单位:100083北京大学基础医学院免疫学系
（编辑秋 实）