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肿瘤分子生物学研究表明，肿瘤的发生、发展是一个多阶段、多基因变异所致的病理过程，包括原癌基因的激活、抑癌基因的失活以及细胞凋亡相关基因的变异。近年来，发现一些细胞因子作为诱导剂，启动肿瘤细胞分化，某些细胞因子具有改变肿瘤细胞癌基因表达。有学者报道 ［1］ ，干扰素可减少肿瘤细胞ras癌基因的表达，重组人肿瘤坏死因子（rTNF）降低卵巢癌3AO细胞c-erbB-2蛋白表达 ［2］ 。本文应用原位分子杂交法及免疫组织化学SP法检测了MGC-803胃癌细胞P53、APC、c-Ha-ras、c-fos基因，并以其为模型，观察rTNF、rIL-2、rIL-6、 60 Co放射线对上述基因的表达调控作用，以探讨这些生物应答调节剂对癌基因表达的影响及其抗肿瘤机制，为进一步临床应用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 RPMI-1640为Life Technologies公司产品，rIL-2、rIL-6为北京四环医学高技术开发部产品，r TNF为邦定生物医学公司产品。
c-fos抗体为Santa Cruz公司产品，Ⅱ抗为生物素标记的抗兔IgG，Ⅲ抗为辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素。Ⅱ抗及Ⅲ抗均为美国VECTOR公司产品。
原位分子杂交所用的P53、APC、c-Ha-ras生物素标记探针均购自北京医科大学病理学教研室，BCIP/NBT为美国ZYMED公司产品。
1.2 肿瘤细胞 MGC-803胃癌细胞株由中国医科大学肿瘤研究所张荫昌教授提供，由本室传代。
1.3 rIL-2、rIL-6、rTNF对MGC-803胃癌细胞的作用 将贴壁生长的MGC-803胃癌细胞株用0.25%胰酶消化，分在不同方瓶中传代培养，细胞进入指数生长期时分别加rTNF1×10 4 U/ml，rIL-6500U/ml，rIL-25000U/ml，对照组不加药，培养6、12、24、48h分别取出制片。
1.4 60 Co放射线照射 传代培养的MGC-803胃癌细胞进入指数生长期时照射 60 Co，照射剂量为100cGy。培养6、12、24、48h分别取出制片。
1.5 免疫组织化学SP法 按常规操作，DAB显色，每次实验均设阳性和阴性对照，c-fos阳性信号分布在胞核及胞浆，阳性率确定按文献 ［4，5］ 进行。
1.6 原位分子杂交 用不含探针的杂交缓冲液42℃孵育1～2h，然后滴加含探针的杂交液（2μg/ml），覆盖玻片，95℃共变性15min，随即反应进行，42℃水浴箱过夜（12～16）。清除未结合的探针，滴加碱性磷酸酶标记的链霉卵白素BCIP/NBT显色，阴性对照设显色阳性片子不加探针。P53、c-Ha-ras阳性信号均分布在胞浆及胞膜内。参照文献 ［3，4］ 确定阳性率。
1.7 统计学方法 两样本率比较的χ 2 检验。
2 结果
2.1 MGC-803胃癌细胞癌基因表达 P53及APC基因均为阴性。c-Ha-ras及c-fos基因均高表达。c-Ha-ras mRNA表达阳性率为99%，c-fos蛋白表达阳性率为98%。
2.2 rTNF对MCG-803胃癌细胞P53、c-Ha-ras、c-fos基因的影响 rTNF同MGC-803胃癌细胞共育后6h P53重现，以后逐渐消失，而c-Ha-ras和c-fos-开始表达而逐渐降低。见表1。
Table1 The effect of rTNF on the expression of P53c-Ha-ras c-fos MGC803cells（略）
注:%:positive cells/200cells; ˇ :compared with control P<0.01
2.3 rIL-6对MGC-803胃癌细胞c-Ha-ras、c-fos基因表达的影响 rIL-6同MGC-803胃癌细胞共育后-开始ras和fos高表达而以后逐渐降低、消失。见表2。
Table2 The effect of rIL-6on the expression of c-Ha-ras c-fos in MGC803cells（略）
注:%:positive cells/200cells; ˇ :compared with control P<0.01
2.4 rIL-2对MGC-803胃癌细胞c-fos基因表达的影响 rIL-2同MGC-803胃癌细胞共育后-开始fos高表达而以后逐渐降低，见表3。
Table3 The effect of rIL-2on the expression of c-fos in MGC803cells（略）
注:%:positive cells/200cells; ˇ :compared with control P<0.01
2.5 60 Co放射线照射MGC-803胃癌细胞早期（6h），无各种基因表达 随着培养时间延长，阳性细胞逐渐增加，晚期有不同程度的c-Ha-ras及c-fos表达。
3 讨论
胃癌的发生、发展是多因素、多阶段、多基因变异所致的癌变过程 ［5］ 。据文献报道，与胃癌有关的基因有c-met、ras、c-erB-2、P53、APC、DCC等，MGC-803胃癌细胞株也有多种基因表达异常。
3.1 检测MGC-803胃癌细胞株癌基因表达 原癌基因的活化和抑癌基因的失活是肿瘤发生、发展的根本原因之一。各种癌都有不同癌基因的表达，MGC-803胃癌细胞株来源于人胃低分化粘液腺癌，形态学特征是上皮性肿瘤。经检测发现本细胞株有c-Ha-ras与c-fos癌基因高表达，说明这些癌基因已被激活。ras基因的编码产物具有GTP酶活性，它的过度表达能启动和加速细胞的增殖，直到引起细胞的恶性转化。fos基因产物是一种脱氧核糖酸结合蛋白，有基因转录调控的作用。fos基因的过度表达，可导致细胞恶性转化及肿瘤形成。
肿瘤专家们更多地关注抑癌基因的变化，认为抑癌基因的缺损和失活是肿瘤发生的根本原因。对本细胞株基因检测发现，P53及APC基因均无表达。张青云等 ［6］ 用PCR方法，对4种人胃癌细胞系进行P53基因变异的检测发现，两种细胞系无P53基因序列的异常。本实验检测P53基因mRNA为阴性，说明它虽以野生型形式存在，但可能因某种原因处于关闭状态，不起细胞生长的负调节作用，从而肿瘤细胞得以生长。此外，与胃癌发生有关的抑癌基因有APC基因。崔建涛等 ［7］ 用PCR方法对4株胃癌细胞系基因检测发现，均有5号染色体长臂缺失。APC基因定位于5号染色体长臂上，说明本细胞株有APC基因缺失，本实验结果与之相符。
MGC-803胃癌细胞株是80年代建起的细胞系，反复冻存，复苏多次，在培养体系中生长活跃，恶性度高，有众多基因异常表达。除上述4种基因以外，还可能存在更多的基因改变，了解所培养癌细胞株的特定基因表达或变异，在抗肿瘤药物的开发及其作用机理的研究中具有重要意义。3.2 rTNF、rIL-6、rIL-2、 60 Co放射线对MGC-803胃癌细胞基因表达的调控 肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor，TNF）是具有多种生物学活性的细胞因子。TNF的生物学活性比当初想象要广泛得多 ［8］ ，在体内、体外均可杀伤或抑制某些肿瘤，还能分化诱导某些肿瘤细胞，对癌基因表达起调控作用 ［9，10］ ，并可诱导细胞凋亡。
有学者 ［11］ 在研究TNF对ME-180人宫颈癌细胞株的影响时发现，TNF对ME-180有细胞毒性作用，同时他们还检测到了DNA的裂解片断，从而认为TNF的细胞毒性是通过凋亡来实现的。1994年，Gotlieb等 ［12］ 在TNF-r对卵巢癌细胞作用的研究中发现其能诱导细胞凋亡，同时还检测出有P53的增强表达，两者有明显的剂量相关关系。本实验也发现TNF具有诱导P53基因表达的作用，支持TNF的细胞毒性及诱导凋亡与P53有关的观点。TNF与细胞接触后并不直接损伤细胞膜，而可能通过受体机制发挥作用。不通过细胞膜把TNF注入细胞浆内无杀伤作用。本实验表明，TNF直接作用于肿瘤细胞可诱导P53基因，抑制已被激活的原癌基因表达，可能也是通过与肿瘤细胞表面的TNF受体结合而发挥作用。
野生型P53是抑癌基因，参与DNA复制的负调节。约有半数肿瘤组织未发现P53基因，多种抗癌剂可诱导P53基因，同时抑制一些与细胞增殖、转化有关的癌基因表达 ［13］ 。本实验发现rTNF明显诱导MGC-803胃癌细胞P53基因，抑制与细胞恶性转化及增殖有关的c-Ha-ras、c-fos基因表达。野生型P53基因导入膀胱癌细胞的研究结果提示，细胞内有足量的野生型P53基因表达，能在转录水平上抑制ras基因表达，通过调控突变的ras基因表达，抑制膀胱癌细胞的恶性增殖 ［14］ 。据报道，TNF抑制K562细胞原癌基因c-fos转录。由此推理，TNF可能与肿瘤细胞表面的TNF受体结合后诱导野生型P53，一方面诱导和促进细胞凋亡，另一方面抑制一些与细胞恶性转化及增殖有关的癌基因的表达来起抗肿瘤作用。
白细胞介素6（IL-6）是一种具有多种功能的细胞因子，除参与免疫调节和造血调控处，还参与机体的抗肿瘤免疫。近年来发现IL-6对多种肿瘤细胞有明显的抑制或杀伤用用，在抗肿瘤免疫方面表现出很大的潜力。本实验发现rIL-6抑制c-Ha-ras转录及c-fos蛋白的表达，可能对MGC-803胃癌细胞的生长及增殖具有抑制作用。
白细胞介素2（IL-2）是最重要的细胞因子之一，其抗肿瘤作用的研究，一直引导着肿瘤生物免疫治疗的方向。据报道，IL-2几乎不直接作用于肿瘤细胞，与T细胞和NK细胞的受体结合，促进这些细胞增殖，而表现出抗肿瘤活性，本实验发现rIL-2直接作用于MGC-803胃癌细胞，降低c-fos蛋白的表达。关于IL-2和IL-6对癌基因表达调控的研究，尚未深入，有待于进一步研究。
本实验发现 60 Co放射线照射的肿瘤细胞，在被照射初 期不表达任何基因，可能是射线直接作用于细胞核，破坏和裂解DNA而杀伤肿瘤细胞有关。射线照射后培养一定时间，部分存活的癌细胞重新表达ras和fos基因，说明肿瘤细胞有相关强的DNA修复能力，这可能是临床上放疗后往往复发的机理之一。
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（收稿日期:2004-04-18）
作者单位:133000吉林延吉延边大学医学院病理学教研室（ △ 通讯作者）
（编辑守 中）