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Key words TNP-470 LA795 apoptosis angiogenesis
实体瘤的生长和转移需要肿瘤新生血管生成，自fockˉman ［1］ 首先提出实体瘤生长需要血管的生成理论后，有关血管抑制剂的研究十分活跃，抗肿瘤血管生成疗法也就成为当前肿瘤生物治疗研究热点之一。本实验利用LA795肺腺癌细胞形成T739小鼠皮下肿瘤动物模型，应用血管生成抑制TNP-470及化疗药CTX，观察单独及联合用药对LA795肺腺癌皮下移植瘤生长的抑制作用，并探讨TNP-470抗肿瘤生长的作用机制。
1 材料和方法
1.1 药物 TNP-470由日本Osaka，Takeda化学工业公司提供，用无水乙醇3ml溶解，97ml生理盐水稀释。CTX为齐鲁制药厂产品，生理盐水溶解。CD34免抗人或鼠一抗（福州迈新公司），bFGF为免抗人或鼠一抗（北京中山公司），PCNA鼠抗鼠一抗以及TUNEL原位凋亡检测试剂盒（武汉博士德公司）。
1.2 动物 40只T739雄性小鼠，鼠龄4～5周，均重20g左右，及2只LA795肺腺癌荷瘤鼠，均由中国医学科学院肿瘤医院动物室提供，中国医学科学院动物研究所提供SPF级饲养环境。
1.3 肿瘤动物模型 断颈处死2只荷瘤鼠，无菌条件下剥离瘤块，按1g肿瘤组织加4ml生理盐水放入表现皿中，用剪刀剪碎肿瘤，然后移入匀浆机中研磨成匀浆液，过360目铜网，生成肿瘤细胞悬液，倒入离心管中，加入生理盐水，显微镜下调节细胞浓度为2×10 6 个/ml，然后于每只雄性T739近交系小鼠右后腿根部外侧皮下注射0.2ml肿瘤细胞悬液，形成小鼠皮下肿瘤动物模型。
1.4 体内实验 40只实验小鼠皮下移植处均成瘤，并随机将其分成5组，每组8只。（1）对照组（给予生理盐水）;（2）溶剂组（给予3%的乙醇）;（3）TNP-470（30mg/kg）;（4）CTX组（40mg/kg）;（5）TNP-470（30mg/kg）+CTX（40mg/kg）。用药均为等量液体注射，TNP-470与3%的乙醇为左侧腹部皮下注射，CTX与生理盐水为左侧腹腔注射。肿瘤移植4d后开始给药，隔日1次，共7次。用药期间每2d测量小鼠皮下肿瘤。肿瘤接种24d后处死全部小鼠，剥离皮下移植瘤，称瘤重，然后浸入10%的中性甲醛溶液固定，石蜡包理、组织切片（4μm），进行免疫组化染色及凋亡检测。
按下列公式计算肿瘤体积和抑瘤率 ［2］ :V=a×b 2 /2，V代表肿瘤体积，a为肿瘤长径，b为肿瘤短径。抑瘤率=1-［E T /E C ］（E C :对照组肿瘤体积或瘤重，E T :用药组肿瘤体积或瘤重）
1.5 各组皮下移植瘤内微血管MVD、bFGF、PCNA表达 采用免疫组化S-P法检测，肿瘤细胞凋亡用TUNEL原位凋亡法检测，方法步骤按试剂盒说明书进行。bFGF的判定标准，高倍镜下计数100个细胞，肿瘤细胞浆中呈棕黄色阳性细胞<5%为阴性，≥5%阳性。采用German KonTKON IBSA2.5全自动图像分析系测定肿瘤组织中bFGF的平均灰度和象素面积，按公式换算成阳性单位（PU），以PU值定量bFGF表达。MVD的判定标准，凡与临近的肿瘤细胞、微血管或结缔组织分开的，呈棕黄色的单个内皮细胞或内皮细胞串计为一个血管，但肌层较厚或管腔面积大于8个红细胞直径的血管不计数。MVD计数参考Weidner等 ［3］ 的方法。PCNA及凋亡计数，任取一张切片，以细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性细胞，选择阳性细胞密集区域，排除坏死区，计数10个高倍视野中阳性细胞数及细胞总数，计数增殖指数SPF和凋亡指数AK。
1.6 统计学处理 所有数据采用均数土标准差（ˉx±s）表示，采用组间t检验，数据分析采用SPSS10.0统计软件完成。 q值= E （A+B） E A +E B （1-E A ） E A 、E B 、E A+B 分别表示TNP-470组、CTX组及联合用药组抑瘤率，根据q值来判断联合用药疗效，若<0.85为拮抗;0.85～1.15为相加;大于1.15为协同。
2 结果
2.1 各组小鼠皮下移植瘤生长情况 接种后，各组皮下移植瘤的体积逐渐增大，肿瘤接种后的第1～4天，移植瘤生长基本相同，18～24d，对照组移植瘤生长明显快于其它3组，TNP+CTX组肿瘤生长最慢。见表1。
表1 4组小鼠皮下肿瘤生长情况 （略）
2.2 各组小鼠皮下肿瘤抑制效果 TNP-470组、CTX组与联合用药组皮下瘤重均明显小于对照组，均具有差异显著性。溶剂组抑瘤率为6.3%，与对照组比较，差异无显著性（P>0.05），因此本研究中TNP-470组、CTX组、TNP+CTX 组的观察结果及抑瘤率结果均与对照组进行比较。TNP-470组抑瘤率为31.4%，CTX组抑瘤率为46.3%，TNP+CTX组抑瘤率明显上升，达81.5%，计算q=1.21>1.15，说明两者联合应用具有协同作用。见表2。
表2 4组小鼠皮下移植瘤重及抑瘤率的比较（略）
2.3 各组肿瘤组织bFGF、MVD的表达 血管内皮细胞生长因子bFGF主要表达于肿瘤细胞的胞浆中，呈棕黄色，见图1。CTX组、TNP-470组、联合用药组与对照组比较，bFGF表达减少，有差异显著性。所有肿瘤组织内MVD均阳性表达，内皮细胞被染成棕黄色，微血管的大小形态差异较大，有的仅为单个内皮细胞或内皮细胞簇，有的细胞不明 显或形态不规则，见图2。联合用药组与其它3组相比，MVD显著减小;TNP-470组与CTX组、对照组比较，MVD也显著减小。这些结果显示，TNP-470能明显抑制肿瘤血管生成，而CTX对小鼠皮下肿瘤内微血管无明显影响，见表3。
表3 各组皮下肿瘤内bFGF、MVD的表达 （略）
注:与对照组比较， △ P<0.05;与对照组比较， △△ P<0.01;与CTX组比较， ※ P<0.05;与对照组比较，◎ P>0.05
2.4 各组肿瘤内增殖PCNA表达与凋亡检测 PCNA核增殖抗原表达于细胞核内而呈棕黄色，见图3。对照组绝大多数细胞核染成棕黄色，PCNA增殖指数为83.8±3.95，联合用药组PCNA增殖指数为55.7±4.32，同TNP-470组（78.8±4.08）或CTX组（65.8±5.06）相比明显减小。镜下凋亡细胞核亦呈棕黄色染色，未凋亡的细胞核呈蓝绿色，见图4。TNP-470组、CTX组、联合用药组凋亡率较对照组明显增高，见表4。
表4 各组肿瘤组织内凋亡指数AK与PCNA增值指数SPF的检测 （略）
注:与对照组比较， ※ P<0.05;与对照组比较， ※※ P<0.01;与对照组比较， △ P>0.05
3 讨论
肿瘤的生长与肿瘤新生血管的形成密切相关，新生血管在为肿瘤细胞增殖提供营养同时，也促发原发肿瘤的播散。虽然抑制肿瘤血管生成是当前生物治疗肿瘤有效方法，但单凭这种治疗方法不可能治愈肿瘤。如何将抗血管生成治疗同其它治疗方法有机结合起来，进行多靶位攻击，以提高肿瘤治疗的疗效，已成为目前研究的热点。TNP-470是一种烟曲霉素人工合成物，通过抑制内皮细胞增殖、迁移而抑制新生血管形成 ［4］ 。实验表明，TNP-470抑制肿瘤的生长主要是通过抑制肿瘤血管形成作用来实现的 ［5］ 。CTX是一种常用化疗药物，具有较好的抗肺腺癌作用，它的作用机理主要是和DNA双链交叉联结，抑制DNA复制，使部分DNA断裂，而杀伤或杀死肿瘤细胞。
本实验结果显示，与TNP-470或CTX单独治疗组相 比，联合用药组移植瘤的生长速度明显减慢，几乎处于停滞状态，最后的重量和体积明显减少，计算q值为1.21，提示二者联合应用有协同作用。免疫组化结果表明，CTX及TNP-470都能降低bFGF分泌，与对照相比差异有显著性，但CTX组肿瘤组织内MVD未见明显减小，而TNP-470组MVD表达明显减小，这说明TNP-470可能从多个环节抑制肿瘤血管的生成，如抑制肿瘤内皮细胞的增殖与迁移，抑制血管内皮细胞其他生长因子如VEGF等 ［5］ 。CTX则单从杀伤杀死肿瘤细胞减小了bFGF分泌，而MVD未见明显减小，这说明肿瘤血管的生成是一个多因素多环节复杂过程，单方面因素抑制并不能完全抑制血管生成。另外CTX降低了PCNA表达，从而抑制肿瘤增殖，相反TNP-470未能明显抑制PCNA表达而抑制肿瘤细胞增殖。用原位凋亡检测法（TUNEL法）检测皮下肿瘤细胞凋亡率，同对照组比，TNP-470、CTX都能提高肿瘤细胞的凋亡率，联合用药组则明显提高肿瘤的凋亡率，凋亡率为38.25%，同对照组相比差异有显著性。这就提示TNP-470抗肿瘤，主要是通过抑制肿瘤血管生成及提高肿瘤细胞的凋亡率来实现的，而CTX则是靠杀伤杀死肿瘤细胞、降低肿瘤细胞的增殖率和提高肿瘤细胞的凋亡率来发挥抗肿瘤效应的，因而两者合用能明显抑制肿瘤的生长，且具有协同性。
总之本实验结果表明，在抑制肿瘤生长方面，虽然化疗药CTX较血管抑制剂TNP-470具有一定优势，但血管抑制剂TNP-470与化疗药CTX联合用药则显著抑制了皮下肿瘤的生长，且具有协同性。因此血管抑制剂TNP-470与化疗药CTX联用是一种很有前途的综合治疗方案，值得临床工作者优先考虑。
（本文图片见封三）（略）
参考文献
1 Folkman J.Tumor angiogenesis:therapeatic implications.N Eng J Med，1971，285（20）:1182-1186.
2 Okeilly MS，Bochm T，Shing Y，et al.Endostatin an trdogenons inˉhibitor of angiogenesis and tumor growth.Cell，1997，88（2）:277-285.
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5 Kato T，Sato K，Kakinama H，et al.Enhanced suppression of tumor growth by combination of angiogenesis inhibitorTNP-470and cytotoxic agents in mice.Cancer Res，1994，54:5143.
（收稿日期:2004-10-18）
ˇ 基金项目:湖南省卫生厅科研资助项目（编号:B2003-090）
作者单位:421001湖南衡阳南华大学附属第一医院呼吸内科
421001湖南衡阳南华大学组织胚胎教研室
100021北京中国医学科学院肿瘤研究所
（编辑李 梁）