Nogo-c基因的克隆、测序及真核表达载体的构建

    【摘要】 目的  克隆Nogo-c的cDNA序列，并构建其真核表达载体，为进一步研究其抑制神经生长机制奠定基础。 方法  根据基因GenBakn中Nogo-c基因的碱基序列，利用RT-PCR的方法从鼠脑组织中扩增编码Nogo-c基因，将目的片段与pMD18T载体连接，利用亚克隆的方法将Nogo-c的cDNA片段克隆到pcDNA3.1载体中，并进行序列测定。 结果  DNA测序证实该片段序列与文献报道完全一致。 结论  成功构建出pcDNA3.1-Nogo-c真核表达载体。
      
　
       
    　Cloning and sequencing of Nogo-c and construction of its eucaryotic expression vector
     
　　Chen Changjie，Zhang Yao
    
　　Department of Molecular Biology and Biochemistry of Bengbu Medical College，Bengbu233003.   
     
　　【Abstract】 Objective To construct recombinant eukaryotic expression vector containing Nogo-c gene se-quence and to pave the way for understanding how the gene inhibits neuron growth.Methods The Nogo-c cDNA was obtained from mouse brain tissue by RT-PCR.The target gene was cloned into pMD18T vector，then subcloned into pcDNA3.1expression vector.Sequencing was employed to identify the correct clones.Results The sequence re-sult showed the mouse Nogo gene is correct according to the reports.Conclusion The recombinant pcDNA3.1-Nogo-c eukaryotic expression vector was successfully constructed.
   
　　Key words cloning Nogo-c eukaryotic expression vector
      
　　哺乳类动物中枢神经损伤后再生困难，是由于各种营养因子严重溃乏;又存在抑制轴突再生的分子 ［1］ 。牛神经突起生长抑制因子bNI220 ［2］ ，以及大鼠和人的bNI220同族体Nogo分子的纯化和鉴定 ［3，4］ ，是中枢神经再生抑制因子研究的重大突破。Nogo被认为是重要的神经突起生长抑制因子 ［5］ 。Nogo有三个异构体，被分别命名为Nogo-A、-B和-C，Nogo的三个异构体是否都具有同样的作用?C在某些神经元及非神经组织中存在，其功能尚不清楚，对No-go-C是否存在抑制作用。为进一步研究Nogo-c的功能及寻找针对Nogo-c可能的功能抑制剂，所以本实验构建Nogo-c真核表达载体。

　　1 材料与方法
    
　　1.1 材料与试剂 质粒pcDNA3.1购自Invitrogen公司;大肠埃希菌DH5α由本室保存;总RNA提取Trizol试剂为Gib-co公司产品;全自动测序由博亚公司完成;限制性内切酶、T4DNA连接酶、RT-PCR Kit均为TakaRa公司产品;其他生化试剂均为国产分析纯。

    　1.2 总RNA的提取细胞 用Trizol试剂参照试剂盒说明书提取细胞总RNA。

    　1.3 RT-PCR扩增 cDNA序列以引物扩增片段cDNA。引物具体序列为5′-AAGCTTATGGACGGACAGAAGAAAC-3′5′-GAATTCTCAATCTGCTTTGCGCTTC-3′，在5′端设计时引入了限制性酶切位点（HindⅢ和EcoRI），参照
TaKaRaone-step RNAPCRkit试剂盒说明书，以1μg总RNA为模板进行RT-PCR，循环参数为:50℃30min，94℃2min，（94℃45s，58℃45s，72℃1min）30个循环，72℃10min。
   
　　1.4 cDNA基因的T-A克隆 DNA和PMD18-TDNA于4℃连接过夜，将连接物转化感受态细菌DH5α，然后再将反应物涂布于LB/Amp/IPTG/Xgal平板，37℃培养过夜。挑取单个白色菌落，置LB/Amp液体培养基中培养，小量提取质粒DNA（PMD18T-Nogo-c），质粒同时进行HindⅢ和RcoRI双酶切，经琼脂糖凝胶电泳鉴定。

   　 1.5 pcDNA3.1-Nogo-c表达载体的构建 用HindⅢ和EcoRI双酶切pMD18T-Nogo-c，将切下的600bp片段回收纯化，连入经相同双酶切的pcDNA3.1载体中，16℃连接过夜，转化大肠埃希菌DH5α，小量抽提质粒，酶切鉴定重组子，以pcDNA3.1上的T7为引物进行测序，DNA分析软件分析测序结果。

　　2 结果
    
　　2.1 PCR产物的电泳结果 提取细胞总RNA，经RT-PCR分别扩增，然后利用PCR法扩增目的片段，见图1。

   　 2.2 pMD18T-Nogo-c酶切鉴定 pMD18T-Nogo-c质粒分别用HindⅢ和EcoRI双酶切鉴定，酶切鉴定结果见图2。

　　2.3 pcDNA3.1-Nogo-c酶切鉴定及测序 酶切出600bp大小产物，见图3。目的基因与GenBank报道结果完全一致，划线部分为起始密码子，测序结果见图4。（图4见封三）
 
　　图1 利用RT-PCR扩增基因1.Nogo-c扩增产物 2.DL2000Marker略
   
　　图2 pMD18T-Nogo-c酶切鉴定1.pMD18T-Nogo-cHindⅢ和EcoRI酶切2.DL2000Marker略
   
　　图3 pcDNA3.1-Nogo-c酶切鉴定1.pcDNA3.1-Nogo-cHindⅢ和EcoRI酶切2.pcDNA3.1-Nogo-c HindⅢ酶切略
   
　　3 讨论
    
　　近年来对中枢神经系统（CNS）纤维再生的认识已发生了根本性改变 ［6，7］ 。目前的共识是，成年CNS神经元再生 能力弱、中枢环境对再生不利。在中枢环境众多不利因素中，近年来发现主要为与髓鞘相关的蛋白，其中尤以Nogo最为重要 ［8］ 。Nogo对神经突起的生长具有很强的抑制作用。而mAbIN1的在体应用大大促进了中枢神经损伤后功能的恢复 ［9］ 。
   
　　Nogo的三个异构体是否都具有同样的作用?三个实验室均认为Nogo-A的全长序列具有最强的抑制作用，No-go-A可能是分子量为250kD的蛋白，能和NI-1结合。Nogo-A只在中枢神经系统的少突胶质细胞表达，Schwann细胞并不表达。Nogo-B和-C在某些神经元及非神经组织中存在，本实验通过RT-PCR技术从鼠脑中获取编码基因全长序列。
   
　　目前对Nogo-B和-C是否存在抑制作用、Nogo-A的结构及功能域的定位还有争议。所以对其功能需要深入的研究，目前的研究多是先提纯蛋白，再用于实验，但蛋白的提取、纯化等步骤较为繁琐，且条件要求很高，为了在体外培养系统中对Nogo-c的功能进行研究，因此本实验成功地扩增了目的基因和构建了真核表达载体pcDNA3.1-No-go-c为深入研究其作用及其作用机制奠定了基础。
    
　　参考文献
    
　1 Dumont AS，Dumont RJ，Oskouian RT.Will improved understanding of the pathophysiological mechanisms involved in acute spinal cord injury improve the potential for therapeutic intervention?Curropin Neurol，2002，15（6）:713-720.

    2 Sillmamm AA，Bandtlow CE，Lottspeich F，et al.Identification and char-acterization of abovine neurite growth inhibitor（bNI220）.J Biol Chem，1998，273（30）:19283-19293.

    3 Chen MS，Huber AB，Haar ME，et al.Nogo A is amyelin associated neu-rite out growth inhibitor and anantigen for monoclonal antibody IN.Na-ture，2000，403（6768）:434-439.

    4 Grandpre T，Nalamura F，Vartanian T，et al.Identification of the Nogo inhibitor of axonregenration as a Reticulon protein.Nature，2000，403（6768）:439-444.

    5 Granpre，Strittmater S.Nogo:A molecular determinant of axonal growth　and regeneration.Neuroscientist，2001，7（5）:377-386.

    6 Bradbury EJ，MoonlDF，Popat RJ，et al.Chondroitinase ABC promotes functional recovery after spinal cord injury.Nature，2002，416（6881）: 636-640.

    7 Fouad K，Dietz V，Schwab ME.Improving axonal growth and functional recovery after experimental spinal cord injury by neutralizing myelina as-sociated inhibitors.Brain Res Brain Res Rev，2001，36（23）:204-212.8 Behar O，MizunoK，Neumann S，et al.Putting the spinal cord togethera　gain.Neuron，2000，26（2）:291-293.

    9 Mckerracher L，Winton M.Nogo on the go.Neuron，2002，36（3）:345-348.      

　　基金项目:安徽省教育厅自然科研项目（编号:2001kj169）

    作者单位:233003安徽蚌埠蚌埠医学院生化与分子生物学教研室

　　（收稿日期:2004-08-06）