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Quantitative detection of anti-IgG by imaging ellipsometric protein chip
Zhu Wei，Zhao Ziyan，Jin Gang，et al.
The Institute of Medical Sciences of Shandong Province，Jinan250062.
【Abstract】 We assembled human IgG as a sensitive layer on silicon bio-chip for detecting anti-IgG by the specific affinity between the antigen and its antibody.The visualization of the binding by imaging ellipsometry.The quantitative measurements of anti-IgG showed that this technique is capable of quantitative detections and can be used clinically in the future.
随着人类基因组测序工作的完成，人类进入了蛋白质组时代，如何快速研究各种蛋白成了本时期重要问题，蛋白芯片以其高通量研究的特点成了解决这一问题的方法。1995年，靳刚和H.Arwin在瑞典合作时提出了光学椭偏成像生物传感器概念，所发展的光学芯片技术，是一种新型的光学生物分子分析技术 ［1］ ，这种技术利用生物分子的特异性结合和一个具有表面增强生物分子特异亲和性捕获功能的多元蛋白芯片和高通量的椭偏成像技术相结合，显示出在芯片表面上有生物分子相互作用引起的蛋白薄层的厚度分布和变化。此技术将多元生物分子相互作用的过程和结果，通过大面积的椭偏分析与快速电子摄像技术定量的显示，形成具有高空间分辨率、快速取样和操作简单等优点的生物分子分析技术 ［2，3］ 。本实验利用这一蛋白分析系统，进行定量检测人免疫球蛋白（IgG）抗体（Anti-IgG）的尝试，以探索椭偏光蛋白芯片检测系统在临床应用的可行性。
1 材料与方法
1.1 材料与器材 椭偏光蛋白芯片分析系统及软件、微流控芯片加样系统（均由中科院力学所研制），单晶硅片（洛阳单晶硅片厂），human IgG及anti-IgG（多克隆抗体）为sigma公司产品。
1.2 芯片处理 将单晶硅片切割成1cm×2cm大小，经过物理和化学洗涤，用硅烷和戊二醛使硅片表面醛基化，用磷酸盐缓冲液（PBS）保存备用。
1.3 芯片制作 将硅片用去离子水冲洗，氮气吹干，固定于微流控加样器上，选取6个加样点，每点加入0.1mg/ml IgG10μl，流速1μl/min×10min;去离子水50μl冲洗10μl/min×5min，然后用1mg/ml牛血清白蛋白（BSA）10μl封闭（1μl/min×10min），再用去离子水50μl冲洗（同前）。
1.4 样品反应 将anti-IgG稀释成200，100，50，20，10μg/ L，每种浓度样本取100μl依次加入各点（最后一点为空白对照），1μl/min×100min，50μl PBS冲洗（同前），以清除非特异性结合的蛋白。
1.5 观测芯片与数据处理 椭偏光蛋白芯片系统观测图像、采取、分析数据信息。以空白点图像灰度值作为零点，减去零点灰度值后即为其余各点灰度值。用SPSS统计软件处理实验数据。实验重复5次。
2 实验结果
用单因素方差分析结果显示5次重复实验之间数据差异无显著性（F=0.769，P>0.05），用LSD法检验，F=0.732，P>0.05，用双变量相关分析所得相关系数为97.7%。
2.1 检测成像及其灰度值 实验图像显示随着被测样品中anti-IgG浓度的增加，其相应灰度值相应增加，反应单元的亮度随之增加（见图1）。
图1 椭偏光蛋白芯片电子图像
2.2 检测Anti-IgG的标准曲线 以各浓度样品5次试验的平均值作横坐标，各浓度样品5次实验对应的反应单元灰度值作纵坐标，做成浓度灰度标准曲线（如图2）。
图2 椭偏光蛋白芯片检测IgG抗体标准曲线
3 讨论
统计分析样品浓度与对应的灰度值相关系数接近于1，可以看出两者之间关系接近于线性关系，从Anti-IgG浓度灰度曲线也可以看出这一关系，此结果与Wang Z H报道一致 ［4］ 。统计分析5次重复的实验结果显示，相同的IgG浓度在反应单元的灰度值差异无显著性，说明用椭偏光蛋白芯片检测系统检测IgG具有较好的稳定性和可重复性。从实验数据中可以看出，有个别同一浓度的样品所对应的反应单元图像灰度值差别较大，可能与微流控加样系统不同流道之间样品运行不够均匀有关系。结论:利用椭偏关蛋白芯片分析系统可以定性或定量检测蛋白分子，并且不需要对待测样品做任何标记。
参考文献
1 G Jin，PTengval，I Lundstrom，et al.Optical biosensor based on imaging ellipsometry for visualization of biomolecular interactions.Biosensers and Bioelectronics，1996，11（5），14.
2 靳刚，王战会.蛋白芯片和其他生物芯片技术.见马立人，蒋中华主编，生物芯片.第二版.北京:化学工业出版社，2002，212-213.
3 孟艳丽，王战会，靳刚.A蛋白定向固定抗体用于椭偏光学生物传感器免疫检测.生物工程学报，2004，20（1），111-114.
4 Wang Z H，Jin G.A label-free multisensing immunosenser based on imaging ellipsometry.Anal Chem，2003，75（22）:6119-6123.
作者单位:250062济南山东省医学科学院药物研究所
100080北京中国科学院力学研究所