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Application and development of selective cancer gene therapy
Wang Sudan
The Hospital of Mid-south National University，Wuhan430074.
【Abstract】 Recently the traditional cancer therapies were realized to be lack of selectiveness and efficiency，as a result the targeted anti-cancer therapies have been studied as a new way.In this review gene therapy of cancer which is selective and oncolytic virus and the problems lie in which were introduced.
肿瘤是一类严重危害人类健康的疾病，伴随着人类对自然的改造进程而产生的环境污染，更使得全球恶性肿瘤患者人数大大增加。据世界卫生组织（WHO）预测，到2005年，全世界各种癌瘤会每年导致630万人死亡。而传统的治疗手段:手术、化疗、放疗这三大疗法由于缺乏靶向性，在治疗肿瘤的同时也大大的损害了机体的正常组织细胞，不能达到良好的抗肿瘤效果。因而近年来有关肿瘤的靶向性治疗方法应运而生。同时，由于大批的研究学者对肿瘤发生的分子机理不断深入的探索研究，基因工程技术发展及与之相匹配的生物技术的完善，使得基因治疗也成为攻克肿瘤新的发展方向。本文就近几年研究热点，即肿瘤的靶向性基因治疗和溶癌病毒的进展及存在的问题做一综述。肿瘤的靶向性治疗是指借助各种对肿瘤细胞有选择性亲和作用的物质将治疗效应限定在特定的靶细胞、组织或器官内，而不损伤正常组织及细胞。基因治疗（Gene Thera-py）是指将外源功能基因通过转基因技术引入特定细胞，并在这些细胞中得以表达，合成蛋白质以纠正遗传缺陷或提供新的功能特性。要实现有效的的肿瘤基因治疗需有抗肿瘤生物学效应的目的基因，安全高效的基因转移载体及可行的基因转移方法。目前，用于肿瘤基因治疗的目的基因及载体有多种可供选择，基因转移方法也日见成熟。现如今研究较多的领域主要是恶性肿瘤的靶向性基因治疗及溶癌病毒。
1 肿瘤基因治疗的靶向性
基因治疗是指将外源功能基因通过转基因技术引入特定细胞，以纠正遗传缺陷或提供新的功能特性，达到疾病治疗之目的的新技术。它做为一种全新的治疗方法引起越来越多的关注。基于抗肿瘤靶向性这一热点问题，基因治疗中许多靶向性治疗的策略也应运而生。治疗基因的靶向性表达主要通过瘤内注射，配体-受体介导的靶向性转基因，载体介导的靶向性转基因及目的基因的组织特异性表达这几个方面来实现。瘤内注射的方法只适用于那些未发生转移的原发性实体瘤，因而其适用范围极为有限，因此，构建能靶向性介导治疗基因转移的载体，配体或组织特异性表达系统成为近年来靶向性肿瘤基因治疗的主要研究方向。
1.1 配体-受体介导的靶向性基因转移 配体介导的靶向性治疗（LTTs） ［1］ 是指利用抗体或其它配体来特异性识别肿瘤相关抗原或受体，从而使肿瘤细胞比正常细胞更易被治疗因素所识别，避免正常细胞受到非特异性杀伤作用。这种治疗方法的运用关键在于配体的选择，因为受体的表达水平，配体与受体的亲合力，以及到底是选用抗体或抗体片段或非抗体性配体等问题都是需要考虑的因素。LTTs用于靶向性抗肿瘤的原理主要有以下两点。
1.1.1 配体能封闭肿瘤细胞表面的某些关键性受体，并降低它们的功能 在最新研究中表皮生长因子受体（EGFR）成为抗肿瘤治疗中的理想靶子。EGFR属于酪氨酸激酶受体（RTKs）中erbB家族成员，它包括:EGFR，HER1，erbB1。EGFR的激活会引起其自身磷酸化及其它许多胞内物质的磷酸化从而促进细胞的有丝分裂与分化能力，上调血管内皮生长因子（VEGF）的表达 ［3］ ，抑制凋亡 ［4］ ，促进瘤细胞的活动，黏附，侵袭能力 ［5］ 。它几乎在所有人类上皮源性肿瘤中有较高的表达，如非小细胞性肺癌，乳腺癌，食道癌，胃癌，膀胱癌等 ［2］ 。EGFR介导的靶向性抗肿瘤治疗包括两个方面，即胞外配体结合区或胞内结合区与相应配体结合均能阻断有利于肿瘤细胞生长的信号的传递。能与EGFR的胞外结合区结合的配体主要是单克隆抗体，双特异性抗体，单链抗体及免疫毒素结合物等;小分子EGFR酪氨酸激酶抑制因子（EGFR-TKIs）则能与ATP竞争胞内段上的ATP结合位点。当抑制性配体（如:IRESSA小分子 ［6］ ，为EGFR-TKI）与EGFR（EGFR，HER1，erbB1）结合后能阻断EGFR自磷酸化及其它胞内分子的磷酸化反应，即阻断了Ras-MAPK及JNK等信号通路的传导，从而下调与上述肿瘤生物学特性有关的转录因子（如:SP1，Elk，Jun，Egr1等），使其恶性表型逆转。
1.1.2 配体能携带治疗因素靶向性抗瘤 以相应的配体为载体将各种治疗药物或制剂定向运抵肿瘤组织，产生杀伤作用，也就是通常所说的“生物导弹”。目前常用的弹头分为:放射性核素，化疗药物，毒素蛋白，酶，生物反应调节剂等。例如将抗体与前体药物酶相连接，即为抗体介导的酶前体药物治疗（ADEPT），ADEPT的设计是为了增加治疗的敏感性和克服肿瘤的耐药性。它通过在肿瘤部位产生很高的药物浓度来杀伤肿瘤细胞。首先，将针对肿瘤的配体连接上前体药物酶输入体内;待配体将前体药物酶连接到瘤细胞表面后再给予前体药物，由于前体药物是无毒的，且只有经过前体药物酶的降解才会产生有细胞毒性作用的药物，且其选择性源于配体与肿瘤组织的特异性亲和力所造成的瘤组织与正常组织的药物活性差别 ［7］ 。
1.2 目的基因表达的靶向性 在近几年的研究中我们发现可以通过组织或细胞特异性启动子来调控基因的特异性表达。外源性治疗用的目的基因在导入细胞后，由于靶细胞内存在特异的转录激活因子可作用于其组织特异性的基因启动子，从而激活治疗基因的转录，使之表达;而其他非靶细胞内由于不含特异的转录激活因子，因而导入这些细胞的外源基因不表达。被选择用于转基因的靶向性表达的启动子多为那些在特定肿瘤细胞中过表达或特异性表达蛋白基因的启动子，如黑色素瘤中的酪氨酸酶（Tyr）基因启动子，结直肠癌及肺癌中的癌胚抗原（CEA）基因启动子，肝细胞癌中的甲胎蛋白（AFP）基因启动子，乳腺癌中的高分子量粘液素样糖蛋白（MUC1）基因启动子及某些Rb基因缺陷肿瘤的E2F基因启动子等。尽管关于这些启动子的报道声称该方法是可以实现靶向性基因表达的，但美中不足的是:这些启动子局限于特定的肿瘤组织而不能广泛同时作用于不同器官或组织的肿瘤细胞，兼有表达效率不高的缺陷;而且上述的基因启动子中绝大多数的功能远不及某些普通的病毒基因启动子，如巨细胞病毒（CMV）早期启动子，Rous肉瘤病毒长末端重复序列（RSV-LTR）和SV40早期启动子。Jian Gu等 ［8］ 利用人端粒逆转录酶（hTERT）基因启动子介导Bax基因靶向性抗肿瘤则大大完善了上述的不足。他所利用的是端粒酶独有的特性。端粒酶是一种特殊的DNA聚合酶，主要功能是复制染色体末端，即端粒。该酶是由一个基本的RNA模板和一些相关蛋白所构成的核蛋白复合物，其中具有催化作用的亚单位即为端粒逆转录酶（TERT）。该酶最为显著的特征是在所有永生细胞系及85%以上的人肿瘤细胞中有极高的活性而在绝大多数正常体细胞中无活性。这是因为hTERT与端粒酶存在正相关的关系，它能大大的提高人端粒酶的活性，延长细胞寿命，从而直接导致了正常细胞向恶性细胞的转化。hTERT基因启动子高度富含G/C，虽缺乏TATA及CAAT盒，但存在几个转录因子结和位点，包括Myc及Sp1，该启动子的核心区为上游转录起始位点，且该区的活性在肿瘤细胞系中上升，在正常细胞中受到抑制，从而完成了对hTERT基因在不同组织细胞中的表达调控，于是Jian Gu等利用该启动子来调控Bax基因的表达。在他们所进行的完全体外转基因实验中分别采用hTERT启动子与CMV启动子来转染不同的肿瘤细胞系，包括人肺癌细胞系（H1299和A549），结肠癌细胞系（DLD1和LoVo），人宫颈癌细胞Hela及两种正常细胞系，结果显示:对于肿瘤细胞而言，hTERT启动子的转基因表答效率仅较CMV高2-3倍;而就正常细胞来说，CMV转基因的表达比hTERT高500多倍，这充分展示了hTERT启动子转基因表达的高效性与特异性。此后进行的体内直接转基因实验也证实了这一点。
2 溶癌病毒
由于病毒能感染敏感细胞并在其中大量复制，最终导致宿主细胞裂解死亡，人们利用该性质研究天然或重组病毒对肿瘤组织的特异性杀伤作用，而这种具有抗肿瘤效应的病毒即为溶癌病毒。目前研究表明溶癌病毒靶向性抗肿瘤的机制主要为以下三点。
2.1 缺陷病毒只能选择性的在肿瘤细胞中增殖，而无法感染正常细胞 多数肿瘤的发生都伴有抑癌基因的突变失活，其中最为重要的是抑癌基因p53的失活，且往往由于它的突变使得受损细胞无法修复或凋亡，才最终导致了肿瘤的发生。正常细胞在受到腺病毒感染后会高水平表达野生型抑癌基因pRB和p53的产物，这是机体的防御措施，但就腺病毒而言，为了进行有效的复制，它将在进入受染细胞后表达其基因组早期区E1基因复合物。其中E1A将与细胞肿瘤抑制因子pRB结合，这使得转录因子E2F得以从pRB/E2F复合物中释放并使细胞进入G1期，同时游离的E2F所介导的一些酶的转录是于细胞S期DNA合成有关的。也就是说E1A在极早期的表达最终是为了完成腺病毒基因组的合成复制;而E1B-55kD的表达是为了拮抗p53蛋白的功能，以避免宿主细胞在p53蛋白的调控下发生细胞周期停滞或凋亡而不利于病毒的复制与增殖，即在腺病毒的复制过程中E1A和E1B基因的产物可拮抗宿主细胞的防御措施。但目前的情况是，肿瘤细胞往往表达的是突变的，无功能的pRB和p53，因而在这些细胞内和基因产物的表达与否不再重要，这就是E1A或E1B缺陷型腺病毒在肿瘤细胞中选择性增殖的原理 ［9］ 。ONYX-015为E1B-55kD基因缺失的腺病毒，它能在p53突变的肿瘤细胞中引起明显的细胞病变效应，但在那些p53基因功能正常的正常人成纤维细胞，上皮细胞中引起的病变却极为有限 ［10］ 。在多种小鼠模型上，ONYX-015对引起p53功能缺陷型肿瘤的抑制和消退是显著的，而且这种抗肿瘤效应是与病毒的复制密切相关的。目前ONYX-015已用与p53缺陷型恶性肿瘤的Ⅰ期和Ⅱ期的临床治疗 ［11］ 。
2.2 将病毒复制关键基因的上游启动子置换为肿瘤特异性启动子或组织特异性启动子 这与靶向性肿瘤基因治疗中目的基因的靶向性表达是相同原理，只不过它所置换的启动子的位置是不同的。在这一部份里，特异性启动子位于病毒复制关键基因的上游处，也就是说它控制着病毒在特定的组织或细胞（如恶性肿瘤组织）中增殖，使其无法在正常细胞中得到复制增殖，从而达到利用病毒来选择性破坏瘤细胞的目的。Dirk M等 ［12］ 构建出能靶向性抗恶性黑色素瘤的新型选择性复制腺病毒（CRADs）AdTry。他们用一个由人类酪氨酸酶基因启动子/增强子结构（hTry2E/P）和一段poly A序列所构成的盒式元件置换了腺病毒E1A基因启动子，使AdTry能选择性的在黑色素瘤中增殖。其实验结果表明，AdTry在黑色素瘤细胞系中引起的细胞毒性作用较在正常细胞系中高出100～1000倍;且该病毒在黑色素瘤细胞中的产量是在正常细胞中的200～800倍以上，证明这种病毒的增殖和复制的选择性是相同的。
2.3 呼肠孤病毒的天然抗肿瘤作用 呼肠孤病毒是无包膜，双链RNA病毒，对人几乎没有致病作用，它最吸引人们关注的一点是它具有天然的，选择性抗肿瘤作用，而这种选择机制直到近几年才被人们所认识。当呼肠孤病毒感染正常小鼠成纤维细胞（NIH3T3）时，病毒的早期转录出的病毒RNA被双链RNA激活的蛋白激酶（PKR）所识别，PKR发生自磷酸化，激活的PKR使eIF-2a发生磷酸化，从而抑制胞内蛋白质翻译的启始，最终导致病毒基因无法转录翻译，病毒复制失败，NIH3T3表现出对呼肠孤病毒的抵抗。然而在那些存在Ras或Ras通道激活的细胞中，情况就完全不同。Ras是酪氨酸激酶信号通路的重要调节分子，过度表达或活化可使信号通路活性增强，引起细胞无限增殖和癌变，而且近30%的人类肿瘤有突变而导致其活性升高的Ras。无论是Ras或Ras通道中的某些因素被激活，都会导致Ras由与GDP结合的静止状态磷酸化为与GTP结合的活化状态，活化Ras的能抑制PKR在受到病毒mRNA刺激时所产生的自磷酸化反应，使病毒mRNA的翻译得以顺利进行，病毒完成其复制与增殖。Coffey等 ［13］ 的实验充分证明了上述理论。他们使用Ras高度活化且可过度表达血小板衍生的生长因子受体（PDGFR）的人成胶质细胞瘤U87细胞及转Ras基因的C3H-10T1/2成纤维细胞。将U87细胞异种移植入严重联合免疫缺陷（SCID）鼠体内;同时将C3H-10T1/2细胞同种移植入C3H鼠体内，待诱发肿瘤形成后，进行瘤内注射病毒，结果显示，肿瘤生长明显受抑，50%以上肿瘤发生消退。
3 问题与展望
靶向性肿瘤治疗已取得较大进展，但无论那种方法都会或多或少的存在问题，这是因为这种治疗手段是受多种因素影响的，包括肿瘤组织的复杂基因起源，转移与否，肿瘤与机体的相互作用关系等都会影响靶向性抗肿瘤的疗效。比如在LTTs中，即便是尽量采用人源性抗体或其它人源性配体，都会或多或少的引发机体产生抗抗体，而使其疗效大打折扣，而且由于瘤细胞源于正常细胞，有时它们之间甚至只有一个碱基不同，因而有时很难从其免疫源性上加以区别，限制了该治疗方法的应用;如果将溶瘤病毒应用于临床，也将不可避免的引发机体对病毒的免疫反应;应用外源性启动子或外源性DNA序列对于基因的长期表达也是不利的，这是因为机体能识别并降解外源性序列;对于复制缺陷性病毒的疗效也受限于其不高的基因转染效率，同时因为这一点，它只能用于瘤内注射途径及小体积肿瘤，从而大大的限制了其应用范围;现阶段所采用的靶向性抗肿瘤方法都缺乏有效的时间及剂量的调控;而且目前对于继发 的全身肿瘤的靶向治疗手段极其缺乏。正是因为以上种种不利因素的存在，使得肿瘤的靶向性治疗离应用于临床还有很长的一段距离，但相信随着技术的进步，未来的治疗可针对肿瘤的组织学类型或其特定的基因背景，诞生一系列分别针对原发或转移瘤的治疗系统，不仅单独使用有良好的效果，而且与传统的治疗手段也能相互结合促进，使人类能最终攻克肿瘤。
参考文献
1 Theresa M，Allen.Ligand-targeted therapeutics in anticancer therapy.Nature Reviews Cancer，2002，2:750-763.
2 Carlos L，Arteaga.Epidermal growth factor receptor dependence in hu-man tumors.:More than just expression?The Oncologist，2002，7:31-39.
3 Radinski R.Growth factor and receptor in cancer metastasis.American Society of Clinical Oncology Educational Book，2000，23-30.
4 Moyer JD，Barbacci EG，Iwata KK，et al.Introduction of apoptosis and cell cycle arrest by CD-358774，an inhibitor of epidermal growth fac-tor receptor tyrosine kinase.Cancer Res，2000，57:4838-4848.
5 Woodburn JR.The epidermal growth factor receptor and its inhibition in cancer therapy.Pharmacol Ther，1999，82:241-250.
6 Lawrence D，Niu J.Protein kinase inhibitors:the tyrosine-specific protein kinase.Pharmacol Ther，1998，77:81-114.
7 魏于全，谢兴红.靶向性肿瘤治疗的研究进展.CSCO2000年第四 届学术年会.
8 Jian Gu，Shunsuke Kagawa，masahiro takakura，et al.Tumor-specific transgene expression from the human telomerase reverse transcriptase promoter enablestargeting of the therapeutic effects of the Bax gene to cancer.Cancer Res，2000，60:5359-5364.
9 John T.Mullen，Kenneth K.Tanabe.Viral oncolysis.The Oncologist，2002，7:106-119.
10 Bischoff JR，Kirn DH，Williams A，et al.An adenovirus mutant that replicates selectively in p53-deficient human tumor cells.Science，1996，274:373-376.
11 Rogulski KR，Freytag SO，Zhang K，et al.In vivo antitumor activity of ONYX-015is influenced by p53status and is augmented by radio-therapy.Cancer Res，2000，60:1193-1196.
12 Dirk M，Nettelbeck，Angel A，et al.Novel oncolytic adenoviruses targeted to melanoma.Cancer Res，2002，62:4663-4670.
13 Coffey MC，Strong JE，Forsyth PA，et al.Reovirus therapy of tumors with activiated Ras pathway.Science，1998，282:1332-1334.
作者单位:430074武汉中南民族大学校医院