CLN8P与ND1相互作用的鉴定

    【摘要】 目的  验证CLN8P与线粒体NADH脱氢酶亚基1（NADH dehydrogenase subunit1，ND1）蛋白质相互作用。 方法  将用酵母双杂交技术筛选出的阳性克隆提取质粒后测序，与CLN8基因表达载体重新共转入酵母细胞，用β-半乳糖苷酶滤膜分析检测，通过滤膜上菌落颜色的改变来确认是否有相互作用。 结果  滤膜上菌落印迹变蓝色，CLN8P与ND1有相互作用。 结论  本试验将筛选得到的阳性克隆质粒ND1与CLN8P一对一重新转入酵母细胞，进一步确认了其相互作用，为下一步的CLN8功能研究奠定基础。
      
　　关键词  酵母双杂交技术 阳性克隆 蛋白质相互作用 CLN8 ND1
      
　　Identification of interaction between CLN8and ND1
    
　　Xiao Weichun，He Shuya，Li Jie，et al.
   
　　Dep of Biochemistry and Molecular Biology of Nahua University，Hengyang421001.
   
　　【Abstract】 Objective Identifying the interaction between CLN8P and NADH dehydrogenase subunit1（ND1）.Methods After isolation the plasmid from the positive clones，they were transfected with CLN8together into competed yeast，then the interaction was observed byβ-galactosidase filter assay.Results The filter turn blue，which suggest the interaction between CLN8P and ND1.Conclusion The test identified the interaction between CLN8P and ND1，and establish the basis for the next study for the CLN8function.
     
　　Key words two yeast hybrid technique Protein interaction positive clones CLN8 ND1
      
　　神经元蜡样脂褐质沉积症（Neuronal ceroid lipofusci-noses，NCLs）是一组儿童常见的进行性神经元变性疾病群，多为常染色体隐性遗传。此疾病群的主要临床症状包括快速的视力恶化，癫痫发作，进行性智力障碍，运动失调和行为变化 ［1］ 。发病年龄可从婴儿至成人，其中，新生儿发病率可高达1/12500。NCLs主要组织细胞病变特征为溶酶体内脂质沉积，最后导致以神经细胞和视网膜细胞为主的细胞凋亡。
   
　　目前认为NCLs至少可分为10种疾病类型，其致病相关基因包括CLN1-10。研究者们已经克隆出其中的6个基因（CLN1-3，CLN5-6，CLN8） ［2～7］ 。CLN8编码区全长861bp，其R24G突变可引起进行性癫痫伴智力障碍。编码蛋白CLN8P是跨膜蛋白，长286个氨基酸，位于内质网 ［8］ ，目前没有发现CLN8P功能研究的报道。筛选并研究CLN8P相互作用蛋白，不但可以初步了解CLN8的功能，还可以为NCL发病机制提供新的依据。本文通过对CLN8P与ND1相互作用的重新鉴定，为CLN8下一步的功能研究奠定基础。
    
　　1 材料
    
　　酵母SD培养基，SD/-Trp，SD/-Ura，SD/-Ura/-His-Trp，SD/-Ura/His-Trp/-Leu培养基，X-α-半乳糖苷酶（GAL）等购自Clontech公司;半乳糖（Gal），棉子糖（Raf），醋酸锂等购自sigma公司;kc8大肠杆菌，EGY48（p8op-lacZ），CLN8编码序列由美国纽约州立人类发育不全研究所Nanbert Zhong博士惠赠，其它化学试剂均国内购买。测序公司为上海生工。

　　2 方法
    
　　2.1 大肠杆菌质粒DNA的提取 提取CLN8-pLEXA-DH5α中含有的CLN8-pLEXA重组质粒，按分子克隆第三版进行。
   
　　2.2 阳性克隆质粒的提取及分离 挑取酵母双杂交技术筛选过程中β-半乳糖苷酶滤膜分析变蓝色酵母克隆质粒（图1），于SD/-Ura/-His-Trp中18～24h，230rpm，电转化至大肠杆菌kc8中，在M9/Amp+/-Trp培养基上筛选阳性靶质粒，挑取克隆提取质粒并测序。
 
　　图1 酵母双杂交技术筛选过程中变蓝色酵母克隆质粒（略）

　　2.3 酵母感受态的制备 从SD/-U平板上挑取EGY48（p8op-lacZ）酵母单克隆至1ml SD/-U液体培养基中，高速振动打散细胞，并将此含有酵母单克隆的SD/-U液体培养基转入50ml SD/-U中，30℃，230rpm，孵育18～24h，至OD 600 ≥1.5。再将此培养基倒入400ml SD/-U中使初始OD 600 =0.2-0.3，30℃，230rpm振摇至OD 600 =0.5±0.1，转移此菌液至50ml离心管。
   
　　2.4 酵母感受态细胞转化 在每一1.5ml EP管中加入100μl制备好的感受态细胞，0.1mg carrier DNA，再分别加入阳性克隆质粒，CLN8质粒，阴性对照质粒（空pLexA载体），阳性对照质粒（plexA-Pos）各0.1μg，混匀。每管再加入0.6ml PEG/LiAC混匀，30℃，200rpm孵育0.5h，再向每管加入100%DMSO100μl，42℃热休克15min，冰上1～2min，14000rpm离心5s，弃上清，1×TE、500μl重悬，取200μl转化后细胞直接涂布于相应缺陷的培养基上。
   
　　2.5 β-半乳糖苷酶滤膜分析 将滤纸裁剪成平皿大小，消毒后将其影印在上述长有酵母菌落的培养皿上，小心取出后置液氮中速冻10s，裂菌，再将菌落面朝上置于另一装有Z-buffer/x-gal的平皿中。室温，8h内观察菌落颜色的变化。
    
　　3 结果
    
　　将酵母双杂交技术筛选得到的阳性克隆质粒测序，得到其序列（如下），并在GenBank进行同源性分析，发现其与人类NADH dehydrogenase subunit1（ND1）一致，同源性为100%。将初步筛选的阳性克隆质粒与CLN8一对一重新共转入酵母细胞，涂布于SD-Ura/His-Trp/-Leu/Raf/Gal，用β-半乳糖苷酶滤膜分析，克隆在8h内均变蓝色（图2）。阴性对照无颜色变化。
 
　　图2 验证相互作用得到蓝色阳性克隆（略）
   
　　4 讨论
    
　　疾病相关基因编码蛋白功能的研究对阐明疾病发生、发展机理有重要意义。基因的表达产物———蛋白在生命活动中并不是孤立存在的，而是与其他蛋白相互作用来执行其特定的功能，所以可以通过寻找未知基因的相互作用蛋白来推测该基因的功能。为此，我们用酵母双杂交系统寻找与CLN8P相互作用的蛋白。
   
　　但是应用酵母双杂交系统筛选相互作用蛋白，在筛选过程可出现假阳性。因此，将筛选得到的阳性质粒一一与诱饵质粒重新共转入酵母菌，可进一步确认其相互作用，减少假阳性率。本研究前一部分应用酵母双杂交体系已筛选得到与CLN8P相互作用蛋白—NADH dehydrogenase subunit1（ND1）。NADH，还原型辅酶Ⅰ尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸，位于线粒体包含5个亚基，ND1为其亚基1。NADH最重要的作用是作为呼吸链的脱氢酶辅酶，其与线粒体的功能密切相关。而进行性癫痫伴智力障碍的病理特点是线粒体内蜡样脂褐质的沉积。我们推测在由CLN8P突变导致的进行性癫痫伴智力障碍的发病过程中，CLN8P突变后其不能与NADH dehydrogenase subunit1相互作用，进而导致NADH功能障碍，细胞不能产生足够的能量，最后可能引起需要能量较多的神经细胞及其视网膜细胞的能量供应不足而致凋亡。因此对其相互作用经过进一步确认可以为下一步的研究工作奠定基础。
     
　　参考文献
    
　　1 KE Wisniewski，E Kida，F Connell，et al.Neuronal ceroid lipofusci-noses:research update.Neurol Sci，2000，21（3Suppl）:49-56.

　　2 I Jarvela，J Schleutker，L Haataja，et al.Infantile form of neuronal ceroid lipofuscinosis（CLN1）maps to the short arm of chromosome1.Genomics，1991，9（1）:170-173.
   
　　3 JD Sharp，RB Wheeler，BD Lake，et al.Loci for classical and a vari-ant late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis map to chromosomes11p15and15q21-23.Hum Mol Genet，Apr1997，6:591-595.

　　4 M Gardiner，A Sandford，MDeadman，et al.Batten disease（Spielmey-er-Vogt disease，juvenile onset neuronal ceroid-lipofuscinosis）gene（CLN3）maps to human chromosome16.Genomics，Oct1990，8（2）:387-390.
   
　　5 M Savukoski，T Klockars，V Holmberg，et al.CLN5，a novel gene en-coding a putative transmembrane protein mutated in Finnish variant late infantile neuronal ceroid ipofuscinosis.Nat Genet，Jul1998，19（3）: 286-288.
   
　　6 B Wheeler，JD Sharp，WA Mitchell，et al.A new locus for variant late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis-CLN7.Mol Genet Metab，Apr1999，66（4）:337-338.
   
　　7 E Tahvanainen，S Ranta，A Hirvasniemi，et al.The Gene for a Reces-sively Inherited Human Childhood Progressive Epilepsy with Mental Re-tardation Maps to the Distal Short Arm of Chromosome8.PNAS，Jul 1994，91:7267-7270.
   
　　8 Liina Lonka，Aija Kytt l，Susanna Ranta，et al.The neuronal ceroid lipofuscinosis CLN8membrane protein is a resident of the endoplasmic reticulum.Hum Mol Genet，2000，9:1691-1697.
    

　　* 基金项目:湖南省教育厅资助项目（编号:04c543）
   
　　作者单位:421001湖南衡阳南华大学生物化学与分子生物学教研室（ △ 通讯作者）
   
　　　　　　　　　　纽约州立人类发育不全研究所（纽约美国NY10314）