利用PEG/PBT构建人工皮肤的试验研究

    【摘要】 目的  在聚乙二醇/聚对苯二甲酸丁二醇酯（PEG/PBT）嵌段共聚物中植入幼儿包皮成纤维细胞，构建人工真皮替代物，以研究细胞的生长、分化、增生及真表皮间的相互作用，为研制大面积创面覆盖物———复合皮奠定基础。 方法  （1）酶消化法培养幼儿成纤维细胞;（2）制备PEG/PBT膜，接种成纤维细胞后于不同时间观察细胞的形态变化;（3）H.E染色;（4）扫描电镜观测PEG/PBT膜的表面是否有成纤维细胞附着;（5）透射电镜观察膜上成纤维细胞形态及结构特点。 结果  （1）利用PEG/PBT膜构建的人工真皮形成后质地与颜色近似真皮组织，有一定的弹性，可出现较明显的细胞增殖，未见人工真皮收缩现象。（2）H.E染色可见PEG/PBT膜呈较均一的淡红色网状分布，成纤维细胞主要分布于胶原膜表面。（3）扫描电镜下可见PEG/PBU膜表面有梭形的成纤维细胞出现，且成纤维细胞紧密贴附于PEG/PBT膜上。（4）透射电镜下见成纤维细胞功能活跃。 结论 成纤维细胞在PEG/PBT膜中有着活跃的生物学特性，以PEG/PBT膜为支架构建的人工真皮具有同正常真皮相似的结构与功能。
      
　　关键词  成纤维细胞 PEG/PBT 皮肤组织工程
      
　　Study on how to make the artificial dermis by PEG/PBT membrane
     
　　Xu Ruixing，Ye ling，Yang Hua，et al.
   
　　Capital University of Medicine Science，Beijing100054.
  
　　【Abstract】 Objective To transplant the fibroblast as the seeding cell into the PEG/PBT membrane in order to investigate the growth，differentiation，increasing and the function between the epidermis and the dermis，simulta-neously，prepare for making the artificial composite skin.Methods （1）Trypsin was used as the isolation medium to get the fibroblast;（2）Prepare for PEG/PBT membrane，the change of cell configuration was observed;（3）H.E staining;（4）Whether the cells attaching into the matrix was observed by scanning electron microscope（SEM）;（5）The construction features of fibroblast in the dermis were observed by transmission electron microscope（TEM）.Results （1）The character and color of the artificial dermis were similar to the normal dermis，the artificial dermis was not fragile，proliferation of the cells could be clearly observed，and contraction of the dermis was not observed.（2）The PEG/PBTmembrane was pale.red color by H.E staining，the fibroblasts were found on the surface of the matrix.（3）There were fusiform cells on the surface of the matrix by SEM，and the cells tightly attach into the membrane.（4）The fibroblasts in the membrane had active biologic function by transmission electron microscope.Conclusion The cul-tured fibroblasts in the membrane had active biologic character，the dermis made by PEG/PBT membrane possessed similar structure and function to the normal skin.
   
　　Key words fibroblast PEG/PBT tissue engineering of skin
      
　　聚乙二醇/聚对苯二甲酸丁二醇酯（PEG/PBT）嵌段共聚物作为一种新兴的生物材料，具有降解产物酸性低，生物相容性好，不易引起受体组织炎症反应，性能优良可调、价廉易得等优点。
   
　　本研究组自行合成的PEG/PBT在前期工作中证明其生物相容性良好，且具有作为皮肤敷料的应用价值。但由于单纯的PEG/PBT膜缺乏活的成纤维细胞，需靠逐渐长入的成纤维细胞分解基质，将延缓真皮重建，因此，利用本实验室已研制成功的PEG/PBT膜，构建了人工真皮，为建立一种新的人工真皮及构建具有表皮结构的人工复合皮提供一种新的途径。

　　1 材料和方法
    
　　1.1 材料 DMEM培养基、胰蛋白酶、胶原酶、小牛血清均购自Gibico公司，PEG/PBT膜由本实验室制备。
   
　　1.2 胎儿成纤维细胞的培养 采用本实验室建立酶消化法培养 ［1］ ，取行包皮环切术的幼儿包皮，采用胰蛋白酶进行酶消化法培养，并进行传代，取其3～4代细胞制备细胞悬液，同时，制备细胞爬片，并对该细胞进行I型胶原和波形蛋白的免疫组织化学染色，步骤如下:制备成功的细胞爬片，置于100%丙酮4℃下固定25min，PBS漂洗，消化，加入鼠抗人的I型胶原抗体（或波形蛋白抗体）（一抗），4℃冰箱过夜，PBS洗，加入生物素标记的羊抗鼠抗体（二抗）37℃30min，滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（三抗），37℃30min，PBS洗，DAB显色，蒸馏水洗，苏木素复染，脱水，透明，封片。用PBS代替一抗作阴性对照。并进行传代和鉴定，取其3～4代细胞制备细胞悬液。
   
　　1.3 人工真皮的构建  60 Coγ射线消毒PEG/PBT膜，用双抗（青霉素1×10 5 U/L、链霉素100mg/L）D-Hanks液彻底冲洗后，加入DMEM培养液浸泡24h，将传代培养的成纤维细胞以3×10 5 /cm 2 密度接种于PEG/PBT膜上（3×10 8 /L，每孔接种1ml，PEG/PBT膜切成1cm 2 大小的正方形），37℃，5%CO 2 条件下培养。
   
　　1.4 H.E染色 培养1～3周，用中性福尔马林液固定，常规组织切片，H.E染色，镜下观察。
   
　　1.5 SEM观察 培养1天、3天、1周、2周、3周，采用SEM观察成纤维细胞在PEG/PBT膜表面的生长状况。具体步骤参照参考文献 ［2］ 。
   
　　1.6 TEM观察 培养1周、2周、3周，按照常规方法利用透射电镜观察PEG/PBT膜成纤维细胞的结构和功能特征。采用仪器为Philips EM400T。

　　2 结果
    
　　2.1 成纤维细胞的鉴定 幼儿包皮成纤维细胞分离培养后，取第3代细胞倒置显微镜下可见细胞呈梭形，免疫组织化学染色显示:Ⅰ型胶原蛋白染色呈强阳性，波形蛋白染色呈强阳性（如图1所示）。透射电镜显示:该细胞呈梭形或不规则，有多个较长的细胞突起;核为卵圆形，核内染色质均匀分布，在核膜下较密集;胞质中有较多的粗面内质网，游离的核糖体较多，高尔基体、线粒体和溶酶体等均可见。并可见细丝状物质。从细胞的形态结构和生长情况表明我们所培养的细胞为较纯净的皮肤成纤维细胞。
   
　　2.2 倒置显微镜下 PEG/PBT膜样品较疏松，透光能力相对较强，在细胞较少时，可观察到表面细胞生长状况。在种植后2h，即可见到成纤维细胞附着于胶原膜上，大部分呈圆形;4h，细胞伸出伪足，贴附较紧密，此时轻轻振摇培养皿，细胞也不易脱落;24h，细胞数量未发生明显变化;72h，细胞开始增殖，细胞数量增多;此后，细胞数量继续增多，至培养后第10天，细胞基本长满表面。但在种植成纤维细胞后，培养板底部可见少量成纤维细胞附着并随培养时间延长而增殖。
   
　　2.3 H.E染色显示 第1周时，细胞附着在脱细胞基质的表面，部分地方连接成片，但未见到成纤维细胞向基质内部生长;第2周时，在基质表面形成一连续的细胞层，且有少量细胞长入脱细胞基质内（如图2所示）;第3周时，基质表面连续细胞层依然存在，长入基质内部的细胞增多。
   
　　2.4 SEM结果显示 第1天在基质表面可见到成纤维细胞附着，有的细胞仍然是圆形，有的细胞则已伸出小的突起，大多数细胞有2～3个突起。第3天成纤维细胞增多，大多数细胞呈长梭形，紧密贴附于基质表面。随着培养时间延长，基质表面细胞逐渐增多，至第2周时，于脱细胞基质的表面基本上长满成纤维细胞（如图3、图4所示）。
   
　　2.5 成纤维细胞在人工真皮中的功能 TEM结果显示:共培养后2周，人工真皮内的成纤维细胞呈梭形或多角形，功能活跃，可见到大量的高尔基复合体和粗面内质网，细胞外可见到新合成的细胞外基质和胶原原纤维。
    
　　3 讨论
    
　　皮肤组织工程产品的出现为各种原因导致的皮肤缺损提供了新的治疗思路，尤其是近十几年来，复合移植方法覆盖Ⅲ度烧伤切痂创面越来越受到人们的重视，其中理想的真皮成分甚为重要。理想的人工真皮，其内部应当具有一定大小孔径，以利于组织的成纤维细胞和毛细血管的长入，并且在移植后保持其网状结构一段时间，即具有合适的被 吸收率及降解速率，同时还应当具有良好的创面黏附性 ［2］ 。与几类常见的可降解高分子材料如聚丙交酯（PLLA）、聚乙交酯（PGA）、聚己内酯（PCL）及其共聚物，及聚酸酐（PCPP）、聚假氨基酸等相比，聚乙二醇/聚对苯二甲酸丁二醇酯（PEG/PBT）嵌段共聚物，具有降解产物酸性低，生物相容性好，不易引起受体组织炎症反应，性能优良可调、价廉易得等优点。荷兰的Isotis植入材料公司十年前将其商业化，取名PolyActive  R ，并就这类材料在骨、软骨、皮肤、鼓膜组织工程和药物缓释载体方面的应用进行了大量研究，取得了一批阶段性的成果，并有部分产品进入临床 ［4～6］ 。受另外一种商品化皮肤覆盖物（Apligraf）采用新生儿细胞作为种子细胞进行同种异体皮移植，而且在临床应用中，极少发生免疫排斥反应的启发 ［7］ ，我们采用胎儿成纤维细胞作为种子细胞，构建了人工真皮。
   
　　经H.E染色、SEM及TEM观察均显示，此PEG/PBT膜与胎儿成纤维细胞结合状态良好，并且随着培养时间的延长，细胞数量逐渐增多，虽然在刚刚将细胞种植于PEG/PBT膜上时，有一部分细胞未能粘附而脱落到培养皿中，但可以采用更换培养皿，将培养皿中的细胞消化下来重新利用，或增大PEG/PBT膜的面积，从而使更多的细胞与基质表面接触并粘附的方法，提高细胞的数量，加以改进，在后面的实验中采用了增大接触面积的方法，细胞粘附率有所提高。
   
　　由于成纤维细胞的存在，在临床应用中，既可增加基质与创面的粘附，促进真皮基质的重建，又可有效调节覆盖于其上的自体皮的生长，促进创面的早期愈合 ［8～10］ ，因此种植有胎儿成纤维细胞的PEG/PBT较单纯的PEG/PBT，具备更大的应用潜力。
   
　　在第10天左右，细胞在基质表面即可覆盖长满，因此，在未来的临床应用中，可在此时，即覆盖创面，再植以自体皮，这也为临床应用节省了时间，同时，也可利用这一支架构建人工复合皮，实现与正常皮肤结构和功能更加近似的人工皮肤的体外重建。（本文图片见附页1）
    
　　参考文献
    
　　1 刘杰，崔雪梅，张燕，等.利用不同支架材料构建人工真皮的研究.中国修复重建外科杂志，2003，17（2）:104-107.
   
　　2 龚志锦，詹洲.病理组织制片和染色技术.上海:上海科学技术出版社，1994，65-66.
   
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　　4 张勇，张爱英，冯增国，等.聚乙二醇共聚对苯二甲酸丁二醇酯的合成及在生物材料中的应用.化学通报，2002，65（5）:304-311.
   
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　　9 Moore JC，Ray AK，Shakespeare PG.Surface ultrastructure of human dermis and wounds.Br J Plast Surg，1993Sep，46（6）:460-465.
    
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　　* 基金项目:北京市教委科技发展计划资助项目（编号:00KJ-107）

　　作者单位:100054北京首都医科大学
   
　　　　　　　100850北京军事医学科学院放射医学研究所