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近年来，组织工程发展迅速。人们已经或正在构建具有生物活性的各种组织工程人工组织，如组织工程人工软骨、骨、皮肤、血管乃至人工肝等，并正在努力将这些“人工组织”植入人体，完成修复、替代病损组织的结构与功能。组织工程的发展和应用不仅可以减少伤残，挽救或延长生命，更重要的是，它标志着“再生医学”新时代的到来，是一场意义深远的医学革命 ［1～3］ 。毫无疑问，随着生物工程的发展，将会赋予组织工程更为丰富的内涵。
1 组织工程学基本原理
组织工程可分为两个主要领域:组织再生和器官替代物（生物人工器官） ［4］ 。组织再生又分为体外组织再生和体内组织再生。体外组织再生是于体外设计、构建人体组织，并用于移植，以替换或修复病损组织。体内组织再生是把含有活细胞成分或不含细胞成分的装置植入体内，以诱导和促进功能组织的再生。这一方法除了要求设计、制备新型生物活性材料以提供细胞粘附和生长的基质外，还需要生长因子等辅助生物材料诱导组织再生。器官替代物是一种含有工程化组织的装置，该装置置于体内或体外，用以替代病损组织或器官的结构和功能。通常的程序是从体内分离细胞，经扩增达到一定数量后，种植在高分子支架上而形成特定形态、结构和功能的人工组织或器官。这一过程可结合基因治疗的方法，通过改变活性细胞成分的遗传特性，使其能表达特殊的功能蛋白从而有效地恢复病理组织或器官的功能，见表1。
表1 组织工程的技术与方法（略）
1.1 组织再生 组织生长发育过程中，不同的细胞是通过一定的机制聚集并分化形成有功能的组织。组织工程的原理是在对细胞进行体外培养的过程中，用工程学的方法和手段操纵这一过程 ［5］ 。一旦组织可在体外大规模构建，即可直接应用于急需新组织的患者，这是一种理想的治疗理念。但目前体外构建成功的仅有真皮、表皮和人工软骨。最近，结合三维（3D）细胞支架，发展了一种可用于体外组织构建的生物反应器系统 ［6］ 。细胞培养系统内，组织构建很大程度地受到微重力的影响 ［7］ 。把平滑肌细胞（SMCs）种植到管状生物可降解支架内，并于脉冲压力环境下进行体外培养，可生成一种血管，其细胞及细胞外基质（ECM）以脉冲压力方向正常排列 ［8］ 。这一发现表明，一旦给予适当的环境刺激细胞排列，细胞可自然地产生反应性组织，通过ECM产物填充其周围环境。但体外组织工程仍然面临许多实际困难:目前的技术只能扩增某一种细胞，只能形成简单的类血管结构 ［9］ 。体内组织再生是利用机体自然愈合过程，以实现组织和器官的自然再生。体内组织再生一旦成为现实并发挥其功能，即可提供比体外组织再生更现实和临床上更易接受的方法。目前，在结合各种技术和方法学的基础上，正在开展广泛的体内组织再生研究，重点是干细胞的研究和应用。
除了细胞因子的可控释放和细胞支架之外，应用于器官和组织体内再生的另一项重要技术即所谓的“物理屏障（physical barrier）”。当组织缺损发生时，其周围逐渐堆积纤维样组织，阻碍了自然组织对缺损的修复。然而，把一种生物膜塞入组织缺损处周围，可以人为地阻止不良组织向内生长，以引导组织再生。这一技术已被用于外周神经、牙周组织和牙槽骨引导组织再生（guided tissue regeneration，GTR） ［10，11］ 。
另外，利用促血管生成的生长因子及其基因促进体内组织再生技术，已用于局部缺血疾病的治疗，例如心肌梗死和闭塞性动脉硬化（ASO）等的治疗 ［12］ 。
1.2 器官替代物 组织工程的另一种方法，是应用同种异体或异种细胞，发展一种所谓的“生物人工器官（bioartifi-cial organs）”来替代器官功能。体内或体外器官替代物的一个关键技术是免疫隔离，即为移植细胞提供保护，使之免受宿主体液和细胞免疫系统的攻击;同时，可保持移植细胞的功能。通过把聚苯乙烯磺酸整合到免疫隔离的水凝胶膜可以有选择地阻止激活的补体渗透入移植物。据报道，已经发现了一种可有效排除某种组分的隔离材料 ［13］ 。在这一方面，非常有前途的是可以诱导细胞移植部位的血管再生。迄今为止，体外器官替代物的主要目标是肝脏，并已经尝试把各种肝细胞与免疫隔离膜相结合。临床上生物人工肝是作为临时辅助装置，应用于肝病患者，直至自然肝功能恢复 ［14］ 。胰岛细胞和肾上腺嗜铬细胞已经用于临床的细胞移植，以治疗糖尿病和Parkinson's综合征 ［13，15，16］ 。进行成功的细胞治疗，其下一步研究是如何保证体内移植的细胞足够的营养和氧供应。
从产物的角度看，除了不含活细胞成分的纯生物活性材料外，工程组织（也称为装置）基本上可分为免疫保护装置和开放装置两个大类 ［17］ 。免疫保护装置的外部采用半透性膜包裹，微孔的直径不超过10nm，只允许小分子物质通过，而截留免疫球蛋白和免疫细胞等，从而避免了宿主对移植物的免疫排斥。该装置的优点是可以采用异体的或异种的细胞，从而大大地扩展了可供选择的细胞范围，其缺点是不能与受体组织整合。开放装置设计的目的是植入体内后，可以与受体组织整合，最终完全取代病损组织。因此，开放装置通常具有较大的孔径，允许受体血管组织的侵入和生长。在材料的选择上，也常常采用可降解性材料。
目前在体外构建含活细胞成分的工程组织的核心方法是，首先分离自体或异体组织的细胞，经体外扩增后达到一定的细胞数量，然后将这些细胞种植在预先构建好的聚合物支架上，这种支架可为细胞提供三维生长环境，在适宜的生长条件下（通常通过培养系统技术对培养条件进行控制），细胞沿聚合物支架迁移、铺展、生长和分化，最终发育形成具有特定结构和功能的工程组织 ［18］ 。
这一技术的关键是在对细胞进行体外培养过程中，通过模拟体内的组织微环境条件，使细胞得以正常生长和分化，主要包含三个关键步骤，见表2。
表2 构建工程组织的三个关键步骤（略）
采用灌注培养系统提供稳定的环境条件 首先需要大规模扩增从体内分离的少量细胞，对于贴壁依赖性细胞，可使用常规的单层培养方法，传代培养后即可达到足够的数量;第二步是将这些细胞种植在聚合物支架上，通过对支架的内部结构与表面性能的优化设计，在细胞-材料及细胞-细胞的相互作用下，诱导细胞进行分化;第三步是采用灌注培养系统，维持稳定的环境条件，使工程组织长期维持分化状态。
采用这一程序已成功地在体外培养了人工软骨、皮肤、肾上皮等多种组织 ［19］ 。
2 组织工程的关键因素
2.1 种子细胞
2.1.1 细胞来源 细胞、支架和生长因子是构建工程组织的三个关键因素。其中一个主要问题是既能在临床上存活又能适用于组织工程的细胞类型的鉴定和分离 ［20］ 。以往，人们认为除皮肤，小肠粘膜和血液外，成年组织中并不存在与组织再生相关的“关键”细胞（如前体细胞或干细胞）。然而，目前已经于多种组织中发现了所谓的“关键细胞”。如造血干细胞、间充质干细胞（MSCs）等。研究显示，MSCs具有定向分化的潜能，可分化成骨、软骨、脂肪和心肌细胞 ［21］ 。分离的人类MSCs现已投入商业应用 ［22］ ，MSC系统可望实现医疗产业化。
组织工程所用的细胞可来源于病人自体细胞，同种异体细胞和异种细胞。
尽管应用异种细胞可能存在感染动物病原体的潜在危险性，但在获得人类供者器官或组织完成自身修复之前，异种细胞可为患病组织提供暂时的支持。
同种异体细胞已被成功地用于治疗皮肤溃疡，糖尿病和肝脏疾病 ［23～25］ 。在美国，FDA批准的两个实验室构建的活皮肤产品已经用于治疗糖尿病或者静脉性皮肤溃疡。其中一个产品由人类新生儿真皮成纤维细胞组成。新生儿成纤维细胞经体外扩增，种植于由聚合物polymer polylactide coglycolide制作的薄支架上，这种聚合物可在水中逐渐降解 ［26］ 。若临床上应用患者自体已分化的MSCs，将不再存在免疫排斥问题。最近，已从胚胎和成年体内分离到各种干细胞，并在细胞分化上显示其灵活性和可控性 ［27］ 。尽管干细胞是一非常有前途的细胞来源，应用于组织工程尚存在一些问题:细胞分离、分化控制及有效性等。组织工程最理想的细胞来源是胚胎干细胞（ES）。ES比MSCs更原始 ［28］ 。ES理论上具有分化成体内各种细胞的潜能。当然，同其它干细胞一样，要把ES应用于组织工程，仍然存在许多问题需要解决。临床上已经应用脐带血中分离的造血干细胞进行骨髓移植，和利用自体软骨细胞修复关节软骨 ［29，30］ 。然而，尽管应用患者自体细胞非常理想，而临床上要获得这样的细胞却很困难。
2.1.2 体外培养系统 细胞扩增和生物功能的保持是组织工程和器官替代物的两大需求。体内组织的生长发育过程是在一定的内环境条件下进行的，常规的体外单层培养方法不能提供组织正常生长发育所需的环境条件，通常的后果是细胞发生分化现象，培养的细胞不仅失去了正常的形态，而且失去了其生化与功能性质 ［31］ 。因而需要建立完善的培养系统以对环境因子进行有效的控制。用于组织工程的培养系统的设计原则是通过模拟在体的内环境条件， 提供工程组织生长发育所需的必要的生化条件，以及针对不同的组织提供细胞分化所需的特殊条件。实现这一目的除了要求提供足够大的传质速率以保证细胞的生长外，还需要根据所培养的组织类型，在反应器的设计上模拟组织生长发育的微环境状态，促进不同细胞的分化。
2.2 支架材料的发展 体内细胞周围的细胞外基质（ECM）不仅支持细胞，还调控细胞增殖、分化和形态发生 ［32］ 。体外组织重建和体内细胞介导的组织再生，同样需要类似的支架材料。细胞若无合适的ECM供应，几乎不可能进行组织缺损的自然再生和修复。而于缺损处预先置入人工ECM支架，即可能促进一系列细胞活性，从而引导组织再生。这一设想已经在应用海绵状I型胶原中得到验证。I型胶原海绵可有效地提高各种组织的再生能力 ［4］ 。细胞一旦粘附到具有理想环境的支架上，其自身可以分泌ECM，从而加速细胞增殖和分化，促进组织自然再生。
外源的三维支架可从三个层次控制组织的生长发育过程 ［5］ :（1）大尺度范围（mm～cm）决定工程组织总的形状和大小;（2）支架孔隙的形态结构和大小（μm级）调节细胞的迁移与生长;（3）用于制造支架的材料的表面化学性质（nm级）调节与其相接触的细胞的粘附、铺展与基因表达过程。
例如，一种含有基底膜的胶原支架，加上含有碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的明胶微粒体，可以诱导小鼠脂肪缺失的皮下组织重新生成脂肪，明显区别于仅含有基底膜的支架或仅包含有bFGF的微粒体。含有bFGF微粒体与基底膜结合使用可促使小鼠皮下形成脂肪组织 ［33］ 。
然而，支架滞留体内时间过长，可阻碍组织再生。因此，需要控制支架在体内的降解能力 ［34］ 。海绵支架的孔径大小也对细胞的浸润和组织再生产生很大影响 ［35］ 。含有多肽序列的水凝胶已经被用于提高某一细胞的粘附能力 ［36］ 。组织工程所用的支架材料包括合成材料与天然材料。合成材料（高分子聚合物等）可以很容易地加工成不同的形态和结构，设计制造过程中能对材料的许多性能进行控制，包括机械强度、亲水性、降解速率等;与之相比，天然材料不易提取和加工，并且材料的物理性能受到限制，但天然材料具有特殊的生物活性并且通常不易引发受体的免疫排斥反应。对组织工程来说，这是一大优点。因此实现材料的优化设计的途径之一，是将化学合成的高分子材料与天然成分偶联在一起形成复合材料 ［37］ 。其中合成材料具有高机械强度、可降解及易加工的性能，而天然成分包含细胞表面受体的特异识别位点，在调控细胞生长发育方面具有特殊生物活性，这对于构建复杂的组织具有重要作用。这一技术已应用于人工血管的内皮化过程 ［38］ 。
2.3 生长因子 仅仅使用细胞和支架，有时并不能使组织再生。这时，需要应用合适的生长因子来促进组织再生。由于生长因子体内稳定性差，还需要对其给予方式作进一步研究。一种可行的策略是于再生部位可控地释放生长因子，使之延续一个较长的时期。药物释放系统（Drug delivery systems，DDS）可使生长因子及基因于体内有效地发挥其生物功能 ［4］ 。一些研究者已经发现生长因子及其质粒DNA的可控释放可诱导有效的血管生成和骨骼再生。
3 组织工程的未来方向
基于目前的技术，体内组织和器官再生的应用还不完善。每一组织和器官均有其自身的代谢特点。心脏、肾脏、脑及体内其它器官均各自发挥其复杂功能。这些器官虽然总重量仅为整个躯体重量的7.7%，却消耗全身3/4的能量。相反，肌肉、皮肤和骨骼占总体重的92.3%，其消耗的能量仅为全身能量的1/4。由于皮肤和骨骼的耗能低，只需要少量的供氧，即可满足其存活及功能维持。这些相对简单组织仅由1～2种细胞组成，内部血管较少，而体内再生能力却很强。因此，一个组织的组织学特征可影响人工诱导的组织再生。
3.1 预血管化（pre-vascularization） 能量需求高的组织或器官，其体内再生需要于整个再生部位建立血管网，以保证足够的营养和氧气供应。最近的一项研究，通过可控地释放水凝胶微粒体内包埋的bFGF，诱导细胞移植部位的前血管化;然后，将胰岛细胞和肝细胞植入预血管化部位，细胞并不能长期存活或维持其生物功能 ［39］ 。但这一试验的目的是2维或准3维的组织结构再生。因此，需要新的方法以在网络血管周围排列功能细胞。
3.2 多细胞再生的发展 肝、肾和肺除3维血管网外，均包含管状结构。管状结构内保持着细胞极性，各种细胞之间存在联系。但这需要进一步的技术和方法学支持，因为目前技术尚无法建立这样的组织结构。Cunha等报道胚胎期的上皮细胞和间充质细胞经器官培养可生成前列腺组织 ［40］ 。虽然胚胎细胞通常比成年细胞具有更多的潜能，但还需要对胚胎细胞的形态发生作进一步研究。
3.3 “内科（Internal medicine）”组织工程 基于传统观念和策略的再生医学方法被称为“外科”组织工程。灵长类的组织再生能力并不都次于那些较低级的动物。一旦发生创伤，通过形成过量的纤维样组织（瘢痕）逐步得以修复，并最终抑制了自然组织再生。这一组织学现象通常见于纤维化疾病。若这种纤维化被抑制，或形成的纤维组织被排除，自然组织可望于治疗部位再生。这一策略被称为“内科”组织工程（‘internal medicine'tissue engineering）。这种方法不仅可对纤维化疾病进行彻底的治疗，还有利于其后自然组织再生。据报道，在博莱霉素诱发的鼠肺纤维化疾病中注射肝细胞生长因子可抑制纤维化改变 ［41］ 。因此，内科组织工程需要应用由蛋白质或基因组成的药物，毫无疑问，DDSs技术在这一方面将发挥主要作用。除了药物释放，DDSs技术也可延长药效并靶向药物至某一部位。例如，DDSs技术可通过把某一药物靶向至需要的部位以帮助内科组织再生并延长其在体内药效时间。
毫无疑问，未来的十年里，组织工程将对医学的发展发挥巨大的作用。目前，FDA批准了至少5个组织工程产品，70多家公司每年花费近60亿美元用以发展新产品 ［42］ 。然而，组织工程仍处于起始阶段，在21世纪，其技术和方法学，需要一定的时间和进一步的发展，使之更加成熟。
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作者单位:
1 130022吉林长春，中国科学院长春应用化学研究所高分子物理与化学国家重点实验室
2 130021吉林长春，吉林大学再生医学科学研究所（△ 通讯作者）
编辑:文 静）