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【摘要】 目的 探讨大肠癌中增殖细胞核抗原(Ki-67)和胎盘型谷胱甘肽-S-转移酶(GST-Pi)、拓扑异构酶-Ⅱ(TOPO-Ⅱ)及P-糖蛋白(Pgp)耐药基因的表达及临床意义。方法 采用即用型免疫组化微波加热法，对170例大肠癌中Ki-67和GST-Pi、TOPO-Ⅱ、Pgp耐药基因的检测分析。结果 (1)170例大肠癌中Ki-67和GST-Pi、TOPO-Ⅱ、Pgp的阳性表达率分别为56.47%和67.05%、44.11%、19.41%。(2)大肠癌中Ki-67的阳生率与GST-Pi、TOPO-Ⅱ阳性表达呈正相关(P＜0.05)。结论 部分大肠癌患者的体内存在多向耐药基因，或增殖活性高的大肠癌具有介导癌细胞内原发存在对GST-Pi、TOPO-Ⅱ和Pgp所介导的抗癌药物的耐药基因。因此，在化疗前对大肠癌中进行Ki-67与耐药基因的检测，有助于预后判断与选择合理联合用药，提高疗效与存活率，延长生存期，具有临床实际意义。
【关键词】 大肠癌；增殖细胞核抗原；耐药基因；免疫组化
Expression of nucleus antigen in proliferation cell and drug resistant gene glutathione-s-transferase-pi，Topoisomerase Ⅱ，P-glycoprotein in large bowel carcinoma
LUO Zhi-mou，JIN Xiao-long，XIE Yun，et al.
The Department of Pathology，Minhang Hospital，Shanghai 201100，China
【Abstract】 Objective To probe into the expression and clinical significance of nucleus antigen in proliferation cell (Ki-67) and drug resistance gene as glutathione-s-transferase-pi (Gst-Pi)，topoisomerase Ⅱ(TOPO-Ⅱ，P-glycoprotein(Pgp) in large bowel carcinoma.Methods To test and analyze the ki-67 and drug resistance gene as GsT-pi、Topo Ⅱ，Pgp in 170 cases of large bowel carcinoma by instant microwave heat-immunohistochemistry.Results (1)Positive expression rates of Ki67，GST-Pi，Topo-Ⅱ，Pgp in 170 cases of large bowel carcinoma were 56.47%，67.05%，44.11% and 19.41%，respectively.(2)There were some correlations among the positive expression of Ki-67，GsT-Pi，and Topo-Ⅱ in large bowel carcinoma (P＜0.05).Conclusion There are presence of multidrug resistance genes in some patients of large bowel carcinoma or resistance to GsT-Pi，Topo-Ⅱ，PgP existed in the fast proliferation cancer cell primarily.So before starting the chemotherapy，determination of Ki-67 and the above resistance gene may be helpful for clinicians to select a rational regime and dosage to impove the curative effect and prolong the life span.
【Key words】 large bowel carcinoma；necleus antigen in proliferation cell；resistame gane；immunohistochemistry
大肠癌具有较高的发病率和死亡率，在上海地区的发病率呈上升趋势，我国大肠癌占恶性肿瘤中的第四或第五位［1］。目前，对大肠癌的治疗主要是手术与化疗，临床医生多采用联合方案或凭主观判断进行用药。最近有研究发现，肿瘤细胞内耐药蛋白往往是导致临床化疗失败的主要原因之一［2］。本文研究通过检测大肠癌化疗前肿瘤细胞的增殖活性与耐药性，旨在判断预后与为防止多种耐药性的诱导方面提供一定的临床病理依据。
1 材料与方法
1.1 材料 收集我院病理科2003年1月～2004年12月外科手术切除的大肠癌标本170例，术前均未做过化疗，男83例，女87例，年龄29～88岁，平均62.85岁。均经HE病理诊断明确。大肠癌的分化程度：高分化管状腺癌42例，中分化管状腺癌70例，低分化管状腺癌29例，粘液腺癌26例，印戒细胞癌3例。大肠癌的临床分期：A期25例，B期55例，C期82例，D期8例。
1.2 方法 标本石蜡连续切片4张，厚3μm，分别免疫组织化学即用型二步染色。检测药盒购自上海长岛抗体诊断试剂有限公司，单克隆抗体。Ki-67阳性者提示肿瘤细胞的增殖活性增强，恶性程度高，预后差；GST-Pi阳性者提示肿瘤细胞对GST-Pi所介导的抗癌药物顺铂有耐药倾向；TOPO-Ⅱ阳性患者提示肿瘤细胞对拓扑异构酶抑制剂有耐药倾向；多药耐药(MDR)基因产物P-糖蛋白(Pgp)的阳性者提示肿瘤细胞对长春新碱类和阿霉素有耐药倾向。并用胃癌肿瘤细胞对Ki-67与GST-Pi、TOPO-Ⅱ、Pgp标记阳性表达作为阳性的对照组。
1.3 结果判断 在光镜观察阳性细胞呈棕褐色细胞颗粒状。Ki-67定位于细胞核内(图1)，GST-Pi定位于细胞核或细胞质内(图2)，TOPO-Ⅱ定位于细胞核内(图3)，MDR定位于细胞质和细胞膜上(图4)。根据肿瘤细胞的阳性数及其染色反应的深浅进行判定，采用高倍视野随机计数500个肿瘤细胞所占的比例，定位3级，未见阳性表达或阳性细胞数＜5%为阴性(-)，5%≤阳性细胞＜30%为阳性(+)，30%≤阳性细胞＜60%为中度阳性(++)，≥60%的为强度(+++)。
1.4 统计学处理 采用卡方检验，P＜0.05有统计学意义。
2 结果
2.1 Ki-67与3种(GST-Pi、TOPO-Ⅱ、Pgp)耐药基因在大肠癌中检测结果 本组大肠癌标本中，Ki-67的阳性表达率为56.47%(96/170)，其表达增殖状态以阳性居多；GST-Pi的阳性表达率为67.06%(114/170)，以强阳性表达居多；TOPO-Ⅱ阳性表达率为44.12%(75/170)，以强阳性表达居多；但Pgp的阳性表达只有19.41%(33/170)，并以弱阳性居多。说明大肠癌中Ki-67阳性表达与GST-Pi、TOPO-Ⅱ的阳性表达呈正相关(r值分别是0.974，0.980，P＜0.05)；但Ki-67的阳性表达与Pgp的阳性表达不相关(r值为0.784，P＞0.05)，提示大肠癌中Ki-67高表达阳性率的细胞肿瘤易对GST-Pi和TOPO-Ⅱ产生耐药性。见表1。
表1 大肠癌中Ki-67和GST-Pi、TOPO-Ⅱ及Pgp的阳性检测结果 略
2.2 Ki-67和GST-Pi、TOPO-Ⅱ及Pgp的表达在组织学类型中关系 本组大肠癌中以中高分化的管状腺癌多见。大肠癌对Ki-67和3种(GST-Pi、TOPO-Ⅱ、Pgp)耐药基因均有不同程度的阳性表达，与不同组织类型大肠癌的阳性表达呈正相关(r值分别为0.988、0.993、0.984、0.958，P＜0.05)。见表2。
表2 Ki-67和GST-Pi、TOPO-Ⅱ、Pgp表达与组织类型关系 略
2.3 大肠癌患者年龄构成分布与Ki-67和3种(GST-Pi、TOPO-Ⅱ、Pgp)耐药表达关系 本组大肠癌中80～89岁12例(7.06%)；以70～79岁病例数最多，为58例(34.11%)；60～69岁45例(26.47%)；50～59岁30例(17.65%)；40～49岁20例(11.76%)；29～39岁5例(2.94%)。文献报道中在我国大肠癌的发病年龄高峰期为30～50岁，国外为50～60岁［3］。本组60～79岁的病例占66.47%(113/170)。大肠癌患者各年龄段对Ki-67和3种(GST-Pi、TOPO-Ⅱ、Pgp)耐药基因均呈不同程度的阳性表达。年龄与Ki-67、GST-Pi、TOPO-Ⅱ的阳性表达呈正相关(r值分别为0.944、0.936和0.926，P＜0.05)；耐药与Pgp的阳性表达不相关(r值为0.350，P＜0.05)。见表3。
表3 年龄分布与Ki-67和GST-Pi、TOPO-Ⅱ、Pgp表达的关系 略
2.4 大肠癌的Dukes分期［4］与Ki-67和GST-Pi、TOPO-Ⅱ、Pgp表达的关系 本组大肠癌的临床分期与Ki-67和GST-Pi、TOPO-Ⅱ的阳性表达呈正相关(r值分别为0.975、0.990、0.982，P＜0.05)；但与Pgp的阳性表达不相关(r值为0.724，P＞0.05)。见表4。
表4 大肠癌的临床分期与Ki-67和GST-Pi、TOPO-Ⅱ、Pgp表达关系 略
3 讨论
许多肿瘤产生耐药的生物学基础取决于肿瘤多药基因的扩增，在肿瘤组织中产生GST-Pi、TOPO-Ⅱ和Pgp的含量升高，则对抗癌药物产生耐药性［5，6］。而影响化疗的主要因素是细胞内耐药、抗肿瘤药的药代动力学/药效学、肿瘤血供、药物扩散PgpMDR及肿瘤细胞增殖生长相关。细胞耐药包括MDR、DNA修复和铂类耐药等，其中MDR的关注点是mdri/Pgp、MDR、LRP、拓扑异构酶-Ⅱ、谷胱甘肽代谢和凋亡，或肿瘤细胞增殖活性介导细胞内多向耐药基因的扩增。
增殖细胞核抗原(Ki-67)对于研究肿瘤细胞的生物化学特性、恶性程度及预后判断等具有一定的价值［7］。Ki-67是真核细胞G1和S期合成的一种36kD的核蛋白，是DNA聚合酶辅助蛋白，直接参与细胞增殖过程中DNA的复制。在静止期的细胞内含量很少，从G1晚期开始增加，S期达到高峰，G2期和M期呈明显下降［8］，其表达程度能客观反映肿瘤细胞增殖活性［9］。本组大肠癌中Ki-67的阳性表达率为56.47%，提示肿瘤细胞增殖状态强的大肠癌易产生对GST-Pi、TOPO-Ⅱ所介导的主要抗癌药物顺铂和拓扑异构酶抑制剂发生耐药性倾向的可能性。但许多肿瘤在化疗前即有耐药基因MDR1、mRNA的水平增高，在治疗后更高［10］。因此，对化疗前筛选出肿瘤细胞无明显耐药性的抗癌药物进行化疗，可进一步提高治疗效果。本组大肠癌中GST-Pi的阳性表达率为67.06%，强阳性高达51.75%；TOPO-Ⅱ的阳性表达率为44.12%，强阳性高达48.00%。说明近一半的大肠癌对GST-Pi、TOPO-Ⅱ所介导的抗癌药物顺铂和拓扑异构酶抑制剂产生耐药倾向，并大多呈强耐药性，且提示大肠癌联合用药化疗时，对顺铂和拓扑异构酶抑制剂的选择应慎重考虑。同时对Pgp的阳性表达率19.41%，表明部分大肠癌对Pgp所介导的主要抗癌药长春新碱、阿霉素等有耐药性倾向。有研究报道，大肠癌在抗癌药物治疗前肿瘤细胞内可原发存在对抗上述抗癌药物的耐药倾向，或部分大肠癌患者体内存在多向耐药基因被激活，这是化疗有时难以达到预期效果的主要因素之一［11，12］。研究结果显示，本组大肠癌对GST-Pi、TOPO-Ⅱ和Pgp均有不同程度的阳性表达，不同组织类型的大肠癌与GST-Pi、TOPO-Ⅱ和Pgp的阳性表达相关，表明采用相同的用药方案治疗不同组织类型的大肠癌，其效果不尽相同，可能存在一定的差异。同时表明，大肠癌中Ki-67与GST-Pi、TOPO-Ⅱ的阳性表达有显著正相关，提示是否有相互介导作用的生物学行为可能性，其发生机理有待进一步研究与探讨。
(本文图片略)
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作者单位：1 201100 上海，上海瑞金医院集团闵行医院病理科
2 200025 上海，上海市瑞金医院病理科
(编辑：文 静)