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【摘要】 基因芯片技术是伴随人类基因组计划实施而发展起来的一门新兴技术，具有高度的并行性、多样化、微型化和自动化等优点，在人类重大疾病发病机理、诊断治疗、药物开发等方面的研究发挥巨大作用。
【关键词】 基因芯片；基因；肿瘤
基因芯片技术1991年被首次提出［1］。通过把巨大数量的寡核苷酸，多核苷酸或cDNA固定于载体上而构成，可一次性对大量序列进行检测和基因分析，在人类重大疾病如癌症、肝脏及心血管疾病的发病机理、诊断治疗、药物开发等方面的研究发挥巨大作用。本文就近年来基因芯片技术的应用研究作一综述。
1 基因芯片技术在医药临床上的应用
1．1 癌症的诊断
基因芯片技术可从疾病及药物两角度对生物体的多个参量同时进行研究，筛选靶标，并获取大量相关信息，有利于探索肿瘤生物学基础。
1.1.1 检测肿瘤基因表达水平
Niu Ruifang等2003年分别用Cy3和Cy5标记正常乳腺组织和乳腺癌组织的mRNA，与癌基因8个抗癌基因分类芯片进行杂交，分析两组表达差异，结果发现差异表达的基因有39个，其中下调表达的基因有8个，上调表达的基因有31个，说明乳腺癌的发生主要与大量癌基因的过量表达相关［2］。郑世荣2001年利用芯片技术观察血卟啉单甲醚(HMME)光动力疗法对人原发性肝癌HEPG2细胞基因表达的影响，探讨HMME作用的分子机制。他们用HMME加激光照射处理培养的肝癌HEPG2细胞，H-E染色观察细胞形态，抽提细胞mRNA，利用荧光标记dUTP逆转录制备cDNA探针，与人肝癌表达谱基因芯片杂交，并对Cy3、Cy5荧光信号作扫描分析，发现光照射后实验组细胞呈凋亡形态，芯片扫描显示2.47%的检测基因(389/1538)出现明显表达差异，其中下调基因占80%，多与细胞增殖调控功能有关，而细胞凋亡通路中几个重要关键蛋白(CCP32、AIF、Mch2)基因表达明显增强［3］。
1.1.2 寻找癌症相关基因
程超2002年利用基因芯片对一高保守基因进行肿瘤相关分析，对大规模人类ｃＤＮＡ测序过程中获得的一条高保守基因序列进行初步功能研究，发现该基因在人类、小鼠、果蝇、拟南芥和裂殖酵母中都有很高的保守性，预测该基因具有肿瘤相关性，ＲＴ-ＰＣＲ分析表明，该基因在成人和胎儿组织中广谱表达，利用基因芯片分析该基因在7例肝癌、5例胰腺癌、2例喉癌和2例肺癌中表达情况，结果证实了该基因与肿瘤形成的相关性，并且提示该基因在不同肿瘤类型中可能处于不同的地位［4］。张效东（2002年）通过以两个胆管癌标本分离到的mRNA逆转录合成探针，分别与尼龙膜上的14802个基因进行杂交，杂交后的膜经扫描成像并进行光密度分析找出表达发生改变的基因，发现表达差异的基因或序列共有754个，其中有455个是已知功能的基因，进一步分析发现30个很有意义，如：MUC18、KGF、TCF-4、PSP94、Smad5、TACC1、α-Catenin、Syndecan-1、Angiogenin、myosin等［5］。祁震宇（2001）抽提正常成人脑组织与人脑胶质瘤组织中的ｍＲＮＡ来制备探针，经杂交、洗涤后，通过计算机表达谱的差异，对436Ｆ11克隆进行Northen blot原位杂交和生物信息分析。分析四次基因芯片筛选，发现15个与胶质瘤相关的新基因，经Northern blot证实436Ｆ11基因在人正常脑组织中表达较高，而在人脑胶质瘤表达较低。原位杂交得到相同的结果。ＢＬＡＳＴｎ和ＢＬＡＳＴｘ分析显示，436Ｆ11基因为全长新基因，编码78个氨基酸，其理论分子量为8.65KＤ，等电点为4.69，与鼠ＰＫＩβ 69%同源，命名为人ＰＫＩβ。说明ＰＫＩβ可能是与人脑胶质瘤形成有关的一条全长新基因，这为脑胶质瘤的基因治疗提供了一条新思路［6］。陈菊祥2000年应用基因微矩阵方法筛选喉鳞癌相关基因。抽提喉鳞癌和对照喉正常组织的总RNA并纯化mRNA；将4096种人类基因PCR产物制成基因芯片；将等量的对照组织和喉鳞癌组织mRNA分别逆转录合成的cDNA第一链作探针，混合后杂交上述基因芯片，经分析芯片荧光信号图像，比较两种组织中差异表达的基因，在4096种基因中，喉鳞状细胞癌与喉正常组织间存在差异表达的基因。所检测的4例临床标本中，2例共有的差异表达基因211～356个(5.15%～8.87%)，3例共有的差异表达基因36个(0.88%)［7］。范保星2001年搜集了60个肺癌相关基因，用修饰后的引物将其分别克隆，经纯化、变性后，制备cDNA Microarray基因芯片，然后将人支气管上皮恶性转化细胞模型BEP2D细胞的原代、20代、35代的总RNA逆转录产物制备探针与基因芯片进行杂交，取得良好的杂交效果［8］。孙颖浩2001年研究膀胱移行上皮细胞癌(ＴＣＣ)和正常组织差异表达基因，应用基因芯片技术对5例ＴＣＣ癌组织和正常组织的ｍＲＮＡ进行检测，在12800个目的基因中共发现差异表达基因384个。在癌组织中87个表达增加，297个表达降低，259个已在ＧｅｎＢａｎｋ中登录［9］。唐榕2000年将人酪蛋白激酶基因ＣＫ1γ1的ｃＤＮＡ与4096个胎脑ｃＤＮＡ一起制备基因芯片，用16种不同组织或细胞系的ｍＲＮＡ分别杂交该基因芯片，与正常人混合组织ｍＲＮＡ作共同对照，检测ＣＫ1γ1基因的表达谱变化，结果显示人ＣＫ1γ1基因在15种组织中的表达没有变化，但在肝癌组织中的表达却显著下调。采集的7例肝癌标本的ｃＤＮＡ与正常肝组织的ｃＤＮＡ重复7次芯片杂交，结果肯定了ＣＫ1γ1基因在肝癌组织中表达降低。同时，对芯片杂交结果通过聚类分析，按基因表达谱特征将ＣＫ1γ1基因与其他7种基因聚类在一起，ＣＫ1γ1基因可能在生物学作用方面与这7种基因有某种相关性［10］。
1.1.3 检测与癌症相关的细胞因子
对白血病发病的研究已达到分子水平，已发现一些癌基因及其编码的生长因子、生长因子受体、第二信使、抑癌基因、凋亡相关基因等与白血病有关。Schena等从人外周血淋巴细胞cDNA文库中获得1046个未知序列的克隆，将其制成DNA芯片，分别与热休克、佛波酯(PMA)处理和未处理的T细胞进行杂交，获得17个热休克相关差异表达的基因，无一个是热休克诱导表达的，6个表达下调，在PMA处理的T细胞6个差异表达的基因中有一个为新基因［11］。Michael等利用DNA微矩阵筛选了白血病细胞株TF1由维甲酸诱发表达的基因，发现B94基因(TN-FAIP2)在正常骨髓细胞和急性白血病M0～M2亚型中均有表达，但在APL中的表达明显降低，经维甲酸作用后B94基因表达上调，说明B94基因可能与APL相关，有可能是ATRA治疗APL的靶基因［12］。
1．2 心血管系统
Ｈａｌｅｙ等利用含8600个ｃＤＮＡ/ＥＳＴ的微阵列，对肿瘤坏死因子(ＴＮＦα)刺激的人主动脉血管平滑肌细胞及粥样硬化的主动脉进行了检测。发现新的化学因子ｅｏｔａｘｉｎ及其受体ＣＣＲ3的表达与动脉粥样硬化的关系极其密切［13～15］。用异丙肾上腺素(ＩＳＯ)和血管紧张素Ⅱ(ＡｎｇⅡ)持续注射可引起明显的心肌肥厚，而及时撤除这种刺激可以逆转心肌肥厚。Ｓｔａｎｔｏｎ等2000年发现，长时程(2～16周)缺血损伤引起的心肌重塑过程中有731个基因的表达发生了改变。其中多种细胞外基质(ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｍａｔｒｉｘ，ＥＣＭ)，包括多种胶原蛋白、层粘连蛋白、ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ、ｆｉｂｒｉｌｌｉｎ、ＥＣＭ2等的表达明显增高；能促进ＥＣＭ沉积的金属蛋白酶抑制剂ＴＩＭＰ 3的表达发生上调。ＥＣＭ表达的增强可引起细胞的黏附、迁移，并增加细胞间的信息交流［16］。
1．3 病毒
基因诊断较传统的检测手段对病原体或病因的检测更直接和更客观，为疾病防治提供更准确的信息，通过分子杂交的方法直接对已知核酸序列的病原体基因片段和已知突变位点的基因片段进行检测。在短时间内对病原体的综合检测、分析及在检测过程中实施各种系统的监控成为可能。
1.3.1 肝炎
赵伟等对15例慢性乙型肝炎患者的血清及肝活检组织，分别用基因芯片、原位分子杂交法、免疫组织化学法、雅培试剂检测HBVDNA、HBcAg、HBsAg、HBeAg。15例患者的血清HBsAg、HBeAg及基因芯片检测均表现阳性。15例肝组织标本中，免疫组化法HBcAg阳性15例，HBV DNA原位分子杂交法阳性14例，基因芯片检测阳性14例。结果表明肝炎基因诊断可同时检测乙肝患者血清及肝组织中的HBV DNA［17，18］。吴海2001年以HBV、HCV高度保守的基因片段为探针，同时用没有同源性的植物基因片段为内参照基因，制备成“乙、丙型肝炎病毒双检基因芯片”，双检基因芯片的内参照结果能做到绝对阳性和绝对阴性，同时对不同血清能有效检测区分［19］。
1.3.2 艾滋病、SARS病毒
已有研究表明人类免疫缺陷病毒1型(ＨＩＶ1)感染影响宿主细胞基因ｍＲＮＡ和蛋白质水平的表达。Ｇｅｉｓｓ等用ｃＤＮＡ芯片分析了近1500个分别感染ＨＩＶ1(ｐ.ｉ.)后2天和3天细胞的ｃＤＮＡ。发现感染2天的宿主细胞基因表达变化很小，但是在感染3天的细胞中有20个基因发生了明显的差异性表达，这些基因包括与Ｔ细胞信号转导、亚细胞交易和转录调控有关的基因以及一些功能位置的基因，证实了ＨＩＶ1感染广泛影响宿主细胞基因表达的假设［20］。周琦2003年建立了基因芯片技术快速检测SARS病毒，通过以SARS冠状病毒TOR2株序列为设计标准，研制出用于检测SARS病毒的全基因芯片，芯片探针长度为70nt，相邻探针序列重复25nt，共660个病毒探针，覆盖了SARS冠状病毒的全部序列。应用该基因芯片对病人、出入境食品、动植物及其产品进行检测，结果表明基因芯片技术检测SARS冠状病毒灵敏度高、特异性强、准确性好，稳定快速［21］。
1．4 致病菌
1.4.1 结核分支杆菌
结核分支杆菌的培养需要复杂的营养条件，生长缓慢，菌种鉴定试验需培养，耗时较长。1998年Ｇｉｎｇｅｒａｓ等利用结核分支杆菌ｒｐｏＢ基因保守区705ｂｐ特异核苷酸序列探针与基因芯片杂交，对10种121株分支杆菌进行基因分型与菌种鉴定。用ｒｐｏＢ寡核苷酸芯片技术与常规双脱氧核苷酸测序方法，分析了10种分支杆菌种间与种内的序列多样性，并确证了几种特异性单碱基多态性。结果在结核分支杆菌ｒｐｏＢ抗药性基因180ｂｐ区内存在3个有意义的特异核苷酸，而其他9种非结核分支杆菌，每种都有其特有的核苷酸定位，联系在一起形成一套特有的分支杆菌指纹图谱，用不同批次制备的高密度寡核苷酸芯片杂交分析，杂交图像十分稳定，保守性、特异性及重复性好［22］。
1.4.2 微生物功能基因组学
微生物功能基因组学研究基因芯片技术能够同时检测大量基因的表达谱，为研究微生物的基因表达调控、细胞信号转导、探索基因功能提供了高效的手段。Ｔａｏ等建立了包含大肠杆菌全基因组序列的芯片，研究生长于不同培养基的大肠杆菌在对数生长后期基因表达的差异，发现生长于富营养培养基的细菌内与翻译相关基因表达有明显上调［23］。Ｚｈｕ利用寡核苷酸芯片对人巨细胞病毒感染引起的宿主细胞基因表达改变进行检测，结果病毒感染前后细胞内258种ｍＲＮＡ水平改变4倍以上［24］。
1．5 人类其他疾病
1.5.1 组织修复
马兵2001年，将4096种人类基因ＰＣＲ产物制成基因芯片，将等量的增生性瘢痕和患者自身正常皮肤组织ｍＲＮＡ分别逆转录合成荧光标记的ｃＤＮＡ混合物探针，与上述基因芯片杂交，分析比较两种组织中差异表达的基因，在4096种基因中，患者的增生性瘢痕及其自身正常皮肤组织间存在差异表达基因，在所检测的3例临床标本中，共有差异表达基因128条，包括细胞凋亡基因、免疫相关基因、细胞骨架和运动基因、原癌基因和抑癌基因、细胞信号和传递蛋白基因等多种基因参与增生性瘢痕的发生［25］。
陈金中2000年用基因芯片分析肥厚性瘢痕与正常皮肤成纤维细胞在静息及ＴＧＦ ｂｅｔａ3刺激下的表达谱的改变正常成纤维细胞在ＴＧＦ ｂｅｔａ3刺激前后的表达谱与肥厚性瘢痕成纤维细胞在ＴＧＦ ｂｅｔａ3刺激前的表达谱呈正相关(ｒ=0.76037)，刺激后2种成纤维细胞的表达差异与肥厚性瘢痕成纤维细胞ＴＧＦ ｂｅｔａ3刺激前后的表达谱差异正相关(ｒ=0.826762)，构成以上差异的基因有620条，涉及细胞骨架蛋白、细胞周期蛋白、细胞因子、受体、转录因子及糖、蛋白质和核酸代谢的酶类，未发现胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ的表达水平的改变，肥厚性瘢痕成纤维细胞在静息状态下表现出与正常细胞受ＴＧＦ ｂｅｔａ3刺激后相似的反应，ＴＧＦ ｂｅｔａ3刺激后2种细胞的反应差异与肥厚性瘢痕细胞的异常反应相关，基因表达变化涉及细胞因子、细胞周期调控、凋亡等，胶原表达无明显上升，表明肥厚性瘢痕发病中，胶原纤维及细胞外基质堆积有复杂的分子生物学基础［26］。
1.5.2 妇产科
ＯｎｏK等运用ｃＤＮＡ微阵列技术检测5例浆液性卵巢癌，4例黏液性卵巢癌病人，与自身无癌变的卵巢组织进行对照，发现用ＣＹ3标记的卵巢癌ｃＤＮＡ探针和用ＣＹ5标记的正常卵巢的ｃＤＮＡ探针与基因芯片上的已知的9121个与癌相关基因的ｃＤＮＡ探针杂交反应后，发现55个基因在6个肿瘤病人中出现上调，48个基因在8个病例中出现下调［27］。Ｗｅｎ等用传统的ＤＮＡ序列分析法和ｃＤＮＡ微阵列分析了108例卵巢肿瘤患者中的ＴＰ53的变化，发现用ｃＤＮＡ微阵列检测的正确率达94%［28］。
2 基因芯片技术在药理学研究中的应用
2.1 动物模型
郭清华2002年以基因芯片技术研究Kkay小鼠2型糖尿病相关基因。用包含8192个小鼠的cDNA基因表达谱芯片研究Kkay2型糖尿病小鼠肝脏的基因表达谱，筛选出差异表达基因154个，包括全长基因68个，表达序列标签(EST)86个，其中40个基因表达增加，114个表达降低，说明cDNA基因芯片技术能够高通量分析糖尿病相关基因［29］。张芳林2002年对老龄组大鼠(30月龄)和年轻对照组大鼠(3月龄)的腓肠肌超微结构进行观察，可以看到前者肌肉肌纤维萎缩伴有线粒体空泡变性。并进行总ＲＮＡ抽提、ｍＲＮＡ纯化、探针制备，应用基因芯片筛选老龄化相关基因，两组大鼠骨骼肌重复出现的差异表达基因127个，下调基因涉及能量代谢、信号转导，上调基因涉及蛋白质分解、细胞凋亡［30］。崔春黎2001年研究正常与糖尿病肾病大鼠肾脏的基因表达谱，大规模分析糖尿病时基因表达水平的变化。将实验大鼠分为两组，一组为正常对照组，另一组为糖尿病肾病组；从肾皮质中抽提ｍＲＮＡ，经反转录分别用Ｃｙ3、Ｃｙ5荧光标记，获得两组动物来源的ｃＤＮＡ探针；ｃＤＮＡ探针与Ｂｉｏｄｏｏｒ基因表达谱芯片杂交，结果由扫描仪扫描并用软件进行分析统计。研究表明8.4%的基因表达谱发生明显的变化，其中12个基因在糖尿病时表达量明显下降，而323个基因在糖尿病时表达量明显上升［31］。
2.2 人红白血病K562细胞株
祝骥2002年用基因芯片研究苦丁茶苷对K562细胞基因表达的影响以人红白血病K562细胞株为材料，应用基因芯片技术研究苦丁茶苷对人红白血病K562细胞作用前后基因表达的差异，以诱导分化药物羟基脲处理作为正对照，分别提取药物处理前后细胞RNA进行逆转录cDNA，使获得的cDNA分别标记上Cy3和Cy5两种荧光物质，与由1632条cDNA片段制作的基因表达谱芯片杂交，经扫描及对获得的数据用相关软件分析，确定K562细胞经苦丁茶苷处理前后差异表达基因48个，有41条与羟基脲处理相同，其中上调表达的基因有32个，下调表达的基因有16个，为进一步建立基因芯片技术药物筛选模型奠定基础［32］。
2.3 中医基础理论
中医在疾病模型基础上通过辨证，区分为不同的证，利用基因芯片技术，观察有关组织基因的变异，以了解证与证、证与病、证与体质之间的差异。当辨证论治取效后，采用基因芯片技术，观察治疗前后有关组织基因转录的差异，不同时段基因转录的差异，揭示证和辨证论治在基因水平上的机制与因果关系，发展证及证治的中医基础理论，制作不同证的基因芯片，用于中医诊断规范化量化研究，使中医药国际市场化［33～35］。
3 展望
基因芯片技术是一种快速、高效的核酸分析手段，它融合生物科学、物理、化学、数学、计算机等多门学科，在临床医学、基础医学、预防医学及工农业等研究中也发挥着重要作用，不仅在基因测序、多态分析、基因表达研究、克隆选择、文库筛选、突变检测、病原诊断等方面有巨大的应用价值，而且在健康保健、药物研究、优生、法医、检疫、食品和环境监测及工农业等领域展现出极大的应用潜力，将给人类社会的发展带来巨大的推动作用。
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作者单位：1 550025 贵州贵阳，贵州省农业生物工程重点实验室，贵州大学
2 550002 贵州贵阳，贵州省生物技术研究开发基地
3 550025 贵州贵阳，教育部绿色药物与农业生物工程省部共建重点实验室，贵州大学
(编辑：悦 铭)