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【摘要】 目的 建立一种快速检测抗H.pylori IgG抗体的胶体金免疫层析试纸条，并优化制备中各关键步骤的实验条件。方法 以柠檬酸三钠还原法制备20nm的胶体金溶液，葡萄球菌A蛋白（SPA），制备免疫胶体金复合物，组装胶体金免疫层析快速诊断试纸条。结果 用柠檬酸还原法制备的20nm胶体金溶液呈亮红色。胶体金标记SPA的最低稳定浓度5μg/ml，最适稳定量为6μg/ ml。SPA标记的最适pH为6.0。以此试纸条检测临床血清标本与进口ELISA试剂盒比较，组间阳性率比较差异无显著性。结论 胶体金免疫层析试纸条质量稳定性不但与抗原抗体的选择、用量优化、层析材料的选择、胶体金的制备与标记等因素密切相关，而且缓冲系统的优化、辅助添加剂的选择与优化组合也非常重要。
【关键词】 幽门螺杆菌；胶体金；免疫层析检测
Research on development of gold immunochromatographic test kit for serum H.pylori antibody IgG
ZHANG Bao-yuan，WANG Xiao-wei，CUI Xiao-dai，et al.Capital Institute of Pediatrics，Beijing 100020，China
【Abstract】 Objective Developing gold immunochromatographic test kit for serum H.pylori antibody IgG and optimize the key experiment conditions.Methods Preparing the colloid gold particles of 20 nm which were coupled with Streptococcus protein A (SPA)，set up the gold immunochromatography test kit for serum H.pylori antibody IgG.Results The spheroidal colloid gold particles of 20nm is shown in color of bright red.The minimal stable concentration (MSC) of gold- SPA is 5μg/ml，and the suitable stable concentration ( SSC) is 6μg/ml.The pH 6.0 is appropriate. 53 sera samples were tested by GICA and ELISA，there is on significant difference between two methods.Conclusion The quality of gold immunochromatography test kit is associated with the factors，such as the quality and quantity of antigen or antibody， colloid gold particles，buffers，etc.
【Key words】 helicobacter pylori;colloid gold;gold immunochromatographic assay
在幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）感染的诊断中，细菌培养、组织病理学检查、尿素酶试验、呼气试验等方法或因为给患者造成的侵入性痛苦，或需要一定的条件和技术，或因为需要特殊仪器，或因为费用昂贵等，其临床推广及多次重复追踪复查受到限制。而血清学检测因其非侵入性、快速、准确，可同时处理大量标本，检测不同类型的抗体，在临床检验、基础研究中倍受青睐。20世纪80年代兴起的胶体金免疫层析检测（gold immunochromagraphy assay，GICA），操作简单快捷、结果清晰易于判断、无需复杂的实验技能和特殊设备，特别适于基层卫生单位使用。本研究预采用H.pylori超声全菌体抗原、葡萄球菌A蛋白（SPA）抗原，尝试研制一种根据双抗原夹心法检测原理检测血清、唾液中抗H.pylori的IgG抗体的胶体金免疫层析检测试剂，优化胶体金免疫层析快速诊断试纸条研制各关键步骤的实验条件，为进一步研制和开发奠定实验基础。
1 材料与方法
1.1 材料
幽门螺杆菌菌种SS1为军事医学科学院微生物与流行病研究所保存；TSB肉汤（Tryptic soy broth）为DIFCO 公司产品；氯金酸（HAuCl4.H2O），上海化学试剂公司产品；柠檬酸三钠（Na3C6H5O7.2H2O），北京北化精细化学品有限公司产品；葡萄球菌A蛋白（SPA）、牛血清白蛋白（BSA），均为Sigma公司产品；聚乙二醇（PEG 20000），FLUKA公司产品;以上试剂均为分析纯。厌氧培养罐AnaeroPack Rectangular Jar为三菱化学公司产品。
1.2 方法
1.2.1 玻璃器皿的清洁
制备胶体金的所用容器均应反复清洗，并硅化处理玻璃容器的内表面，最后用MQ超纯水冲洗晾干备用。
1.2.2 胶体金颗粒的制备
取1%氯金酸溶液1ml，加99ml超纯水成终浓度0.01% 的氯金酸溶液，加热沸腾后，取1%柠檬酸三钠1.6ml一次性迅速加入煮沸的氯金酸溶液中，继续加热至溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为亮红色，颜色稳定后继续加热5min，室温冷却，补充失水至原体积。
1.2.3 免疫胶体金复合物的制备
1.2.3.1 胶体金标记蛋白最低稳定浓度与最适稳定量的确定
目测法确定胶体金与待标记蛋白质用量比例：用0.1mol/L的碳酸钾溶液调节胶体金溶液的pH至5.9～6.2，取11支洁净试管分装胶体金溶液（1ml/管）。将待标记蛋白质SPA逐级稀释后（由2～10μg另设对照管），各取等体积顺序加入一系列装有1ml胶体金的试管中，混匀；5min后，在上述各管内分别加入10%氯化钠溶液0.1ml，混匀，室温静置。依表1顺序进行。表1 胶体金标记SPA的最低稳定浓度实验（略）
(1)室温静置2h以上观察结果；(2)未加SPA的11号管为对照管；1号管既不加SPA也不加氯化钠溶液同样设为对照；(3)未加蛋白及加入蛋白量不足以稳定胶体金的试管，即呈现由红变蓝的聚沉现象，而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的试管则保持胶体金的红色不变。以此使胶体金红色不变而蛋白质含量最低的试管的蛋白量，即为稳定1ml胶体金的必需蛋白量，也即最低稳定量。在此基础上再加20%即为稳定1ml胶体金所需蛋白质的实际最适用量。
1.2.3.2 最适标记pH的确定
调节胶体金溶液pH依次为4、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0，配合上述最低稳定量实验，确定标记蛋白的最佳标记pH。
1.2.3.3 SPA标记胶体金
当蛋白质的最适稳定量及标记的最佳pH值被确定以后便可进行标记。具体步骤如下：按最低稳定量的120%计算出所需待标记蛋白质的总量。在磁力搅拌下，将蛋白质溶液加入胶体金溶液中（pH已调至5.9～6.2），加入蛋白质时应逐滴加入，1mg的蛋白质大约5min加完。分别取1ml胶体金-SPA结合物液（实验组）和1ml胶体金原液（对照组）于试管中加10%氯化钠溶液0.1ml，室温静置1h，观察结果：如果对照组试管溶液由红色转为蓝色，甚至可以看到聚合物沉淀，而实验组溶液仍保持红色，无沉淀，方可继续下一步实验，否则需补加标记用蛋白SPA。最后加入终浓度为0.2%的聚乙二醇（PEG MW20000），继续搅拌30min。
1.2.4 胶体金标记SPA复合物的纯化
超速离心法纯化免疫胶体金复合物。先以3500rpm离心20min（4℃），弃沉淀将上清以13500rpm离心35min（4℃），弃上清，用保存液悬起较疏松的红色沉积物；再以11000rpm离心35min（4℃），小心移弃上清后，用保存液悬起较疏松的红色沉积物至原体积1/10，即为初步纯化的免疫胶体金复合物。
1.2.5 胶体金标记蛋白质的检定
定量测定：以保存液作对照测530nm处OD值，4℃避光保存。质量鉴定：用有Formvar 膜的镍网沾取金标蛋白溶液，空气中干燥后醋酸铀负染，在Tecnai10透射电镜下观察。
1.2.6 金标垫的制备
1.2.6.1 免疫胶体金复合物稀释度的确定
纯化的胶体金标记SPA作不同程度稀释后，均匀等量浸于同样大小的玻璃纤维素膜制成金标垫。组装试纸条，在其他条件不变的情况下，根据反应结果，确定达到试纸条敏感度要求的最适胶体金标记SPA的稀释度，或称为工作浓度。
1.2.6.2 金标垫的制备
保存液稀释胶体金标记SPA复合物原液至工作浓度，按比例均匀浸于玻璃纤维素膜，-20℃冻存，冷冻真空干燥后，密封保存。
1.2.7 H.pylori全菌超声粉碎抗原的制备［1］
幽门螺杆菌SS1采用TSB固体斜面培养基微需氧（5%O2、10%CO2、85%N2）37℃培养，72h后转种TSB液体培养基，37℃振荡培养60h后收集菌体。H.pylori菌体用小体积生理盐水悬浮，冰浴条件下超声粉碎有效时间5min（150W），超声粉碎置显微镜下观察呈均匀细颗粒状；4℃，12000r/min离心20min，收集上清；细菌沉渣再重复超声5min，重复离心过程取上清；合并2次上清，于0.01mol/L的PB缓冲液（pH 7.2）中透析24h，中间换液3次，最后12000 r/min离心20min，上清测蛋白浓度后分装，于-20℃保存。
1.2.8 H.pylori配体固相硝酸纤维素膜的制备
H.pylor抗原室温融化后，12000r/min离心10min，取上清2mg/ml用0.01mol/L的PB缓冲液（pH 7.2）以250μg/ml间隔，经BIO-DOT型XYZ3000点样仪dispenser线形包被于硝酸纤维素膜的观察结果的测试反应区，定义为检测带（T），距离检测带5mm远的质控带（C）用dispenser线形包被正常兔IgG(2mg/ml)。37℃干燥2h，4℃密封保存。
1.2.9 样品垫的处理
选择适当的封闭试剂、表面活性剂和(或)非离子型去污剂单独或以适当比例组合后均匀浸于玻璃纤维素膜，室温干燥备用。
1.2.10 试纸条组装
根据功能不同可将试纸条分为四个部分：上段（A区）为手持部位（吸水滤纸：吸收检测样品中多余液体），中段（B区）为实验反应区（硝酸纤维素膜：包括判读结果的检测带T和指示试纸条质量的质控带C），下段（D区）为样品区（玻璃纤维素膜：接触待检测样品），在中下段之间（C区）放置浸有胶体金标记SPA复合物的金标垫；而整个试纸条贴附于双面胶白色塑料背板（见图1）。
1.3 临床血清标本H.pylor抗体IgG检测
取1998年3月～2001年9月期间在我院消化门诊就诊，临床诊断为幽门螺杆菌胃炎患儿血清53份。加入80μl 于试纸条样品区，2～5min开始观察结果，20min观察终止。出现1条红色（对照）沉淀线，为血清学诊断阴性；出现2条红色（样品和对照）沉淀线，为血清学诊断阳性。同时采用华美生物工程公司ELISA试剂盒对血清标本进行对照检测。组间阳性率采用U检验分析。
2 实验结果
2.1 胶体金颗粒制备
我们实验所用柠檬酸还原法制备的20nm胶体金溶液呈亮红色，用预先处理好的覆有Formvar膜的镍网浸胶体金后在透射电镜下观察，可见金颗粒大小基本一致，分布均匀，圆形（图2）。测量100个胶体金颗粒直径，计算平均直径约20nm。
2.2 胶体金标记SPA的最低稳定浓度、最适稳定量及最适pH
加入不同浓度SPA的胶体金溶液在加入氯化钠后呈现不同颜色（由蓝色伴聚合物沉淀逐渐过渡到亮红色），使胶体金溶液红色不变而蛋白质含量最低的试管中加入5μg SPA，因此确定本次制备的20nm胶体金标记SPA的最低稳定量是每毫升胶体金溶液5μg SPA，最适稳定量为每毫升胶体金溶液6μg SPA。胶体金与蛋白质的结合成功与否，取决于pH值，一般只有在蛋白质等电点（PI）略偏碱的条件下二者才能牢固地结合，实验证实SPA标记的最适pH为6.0，符合理论预测。
2.3 胶体金标记SPA复合物的制备与纯化
将胶体金溶液pH值调至6.0，30ml胶体金溶液在磁力搅拌下缓缓加入180μl SPA溶液（1mg/ml），加入PEG20000增加胶体金溶液的稳定性，超速离心纯化后在Tecnai10透射电镜下观察，可见金颗粒外围有明显的低电子密度晕圈，表明金颗粒表面吸附有蛋白（图3）。
2.4 临床血清标本H.pylor抗体IgG检测结果
53份受检血清中抗Hp血清抗体IgG胶体金法阳性21份，疑似7份，阴性25份；ELISA法阳性19份，疑似6份，阴性28份。组间阳性率比较差异无显著性（U检验，P＞0.05）。表3 两种方法检测临床血清标本H.pylor抗体IgG结果比较（略）
3 讨论
胶体金标记技术是以胶体金作为示踪标志物或显色剂，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术，现在已成功用于电镜、流式细胞仪、免疫印迹、蛋白染色、体外诊断制剂的制造等领域。胶体金的制备并不难，但要制备高质量的胶体金却并非易事，通过反复实验我们总结出如下经验：(1)所用化学试剂应为分析纯试剂，试剂质量直接影响胶体金制备的成功与否；(2)配制溶液用水应为双蒸水或MQ超纯水，而且必须注意到不同来源的水其pH和离子强度有很大差异；(3)玻璃器皿的清洁是非常关键的一步。如果玻璃器皿内不干净或者有灰尘落入就会干扰胶体金颗粒的生成，形成的颗粒大小不一，颜色微红、无色或混浊不透明。合格胶体金溶液应清亮透明，若混浊或液体表面有漂浮物，提示此次制备胶体金有较多凝集颗粒。胶体金粒子大小不同，颜色亦不同［2］：5～20nm之间，呈葡萄酒红色；20～40nm之间液体为深红色；60nm金溶液呈紫红色，日光下仔细观察比较胶体金的颜色，可以粗略估计制得金颗粒大小。不同大小的胶体金粒子具有不同的光散射作用，据此可用可见光光谱法评价胶体金的粒径及分布［3］。
鉴定胶体金最有说服力的是在透射电镜下观察，理想的金颗粒是大小基本相等，均匀一致，无椭圆形及多角形的金颗粒存在。拍片放大后测量金颗粒直径，符合制备要求。小颗粒胶体金基本是圆球形，30～80nm金颗粒则多为偏心圆形［2］。如果金颗粒大小不等或有椭圆形、三角形金颗粒存在应重新制备，造成这种情况的主要原因一般与在加还原剂时没有迅速一次性加入以及搅拌不均匀有关；此外制备量的多少、容器的大小、加热的时间等也影响胶体金颗粒的大小。制备好的胶体金可因电解质、温度、金溶液的浓度变化而有不稳定和聚沉。因此，制备后最好在20天以内进行标记，室温或4℃保存，避免低温冻存。实验中我们选择添加牛血清白蛋白作为稳定剂以维持胶体金的稳定性，使之便于长期保存，并防止或减少免疫金复合物的非特异性吸附反应。牛血清白蛋白、PEG20000是最为常用的高分子稳定剂［4］。
胶体金颗粒与蛋白质的结合一般通过静电感应、蛋白质疏水作用吸附于金颗粒表面，或通过蛋白质中半胱氨酸的硫残基与金颗粒的电子层发生配位结合［5］。无论其作用机制为何，环境pH和离子强度是影响吸附的主要因素，一般只有在蛋白质等电点略偏碱的条件下二者才能牢固地结合，因此，标记之前须用0.1mol/L碳酸钾溶液或0.1N 盐酸将胶体金溶液的pH值调至待标记蛋白质等电点略偏碱。由于胶体金会阻塞pH计电极，不可直接将电极插入胶体金溶液中，用精密的pH试纸测定其pH即可。
标记好的免疫胶体金纯化处理的目的是除去其中未标记的蛋白质、未充分标记的胶体金以及在标记过程中可能形成的各种聚合物。根据胶体金颗粒大小不同和所标记蛋白质的特性不同，选择并调整离心转速和离心时间可以达到一般的纯化目的。如有需要可将上述初步纯化免疫胶体金用10%～30%蔗糖或甘油溶液做密度梯度离心或用凝胶过滤法进一步纯化。
胶体金免疫层析试纸条的研制不仅在抗原抗体的选择、用量优化、层析材料的选择、胶体金的制备与标记等方面至关重要，而且缓冲系统的优化尤其是各种辅助添加剂的选择，优化组合也必不可少。为确保试剂盒的稳定性，试纸条的组装须在洁净干燥的环境下进行，空气湿度＜20%为宜。本试验制备的检测H.pylori IgG抗体的胶体金免疫层析试纸条经临床血清标本检测，初步结果与国产ELISA试剂盒比较差异无显著性，说明两种方法在特异性、敏感性和稳定性有较好的一致性。
本研究旨在探索优化胶体金免疫层析诊断试纸条的研制技术，建立胶体金快速诊断层析试纸条研制的技术平台，从而为研究和开发系列胶体金免疫层析快速诊断试纸条提供有重要价值的实验依据和经验参考。(本文图片见附页1)
【参考文献】
1 陈敏章，胡伏莲，周殿元，等.幽门螺杆菌感染的基础与临床.北京：中国科学技术出版社，1997，322.
2 Bassab C，Syamal R.Manufacturing high-quality gold sol.IVD Technology，2001，8：46-54.
3 彭剑淳，刘晓达，丁晓萍，等.可见光光谱法评价胶体金粒径及分布.军事医学科学院院刊，2000，24（3）：75-77.
4 Hayat MA.Colloidal gold-principles，methods and applications.San Diego：Academic Press，1989，2-10.
5 Hermanson GT.Bioconjugate techniques.Academic Press，1996，593-602.
作者单位：1 100020 北京，首都儿科研究所
2 100071 北京，军事医学科学院微生物与流行病学研究所
(编辑：文静)