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【摘要】 目的 探讨胆囊良恶性肿瘤中P16蛋白表达与临床病理特征的关系。方法 采用免疫组化Envision二步法，检测46例胆囊癌，20例胆囊腺瘤的表达水平，并用24例正常胆囊黏膜作对照。 结果 P16蛋白在胆囊癌中的阳性表达率53.0%，明显低于胆囊腺瘤（90.0%）及正常黏膜（92.1%），P＜0.05。在胆囊癌的低分化组低于高、中分化组，在S4～S5期低于S1～S2期，其组间比较均差异有显著性，P＜0.05。 结论 P16蛋白在胆囊良恶性病变中表达与胆囊癌的病理分型、分化程度及Nevin分期均有密切相关，提示该项指标可作为胆囊良恶性肿瘤的鉴别诊断与胆囊癌的预后判断指标之一。
【关键词】 胆囊腺瘤；胆囊癌；P16基因；免疫组化
To study the expression of p16 protein and discuss its clinical significance in benign and malignant gallbladder tumors
JIN Zhi-ming, LUO Zhi-mou, MA Ai-guo. The Pathology Department, Wujing Hospital, Minhang, Shanghai 201100,China
【Abstract】 Objective To discuss the expression of p16 protein and its clinical pathological characteristics in the benign and malignant gallbladder tumors. Methods p16 protein was detected in 46 cases of gallbladder carcinoma, 20 cases of gallbladder adenoma, 24 cases of normal gallbladder mucosa with immunohistochemical Envision. Results The positive rates of p16 protein were 53.0%, 90.0% and 92.1% in gallbladder carcinoma, gallbladder adenoma, normal gallbladder mucosa respectively. The positive rate of p16 protein in gallbladder carcinoma was higher than those in gallbladder adenoma and normal gallbladder mucosa (P<0.05). The positive rate of p16 protein in low differentiation group was significantly lower than those in middle and high differentiation groups in gallbladder carcinoma (P<0.05). The positive rate of p16 protein in S4-S5 phase was significantly lower than those in S1-S2 phase in gallbladder carcinoma (P<0.05). Conclusions The expression of p16 protein was related to benign or malignant, pathological types, differentiation and Nevin phase in gallbladder tumors. P16 protein may be an indication of diagnosis and prognosis in gallbladder carcinoma.
【Key words】 gallbladder adenoma； gallbladder carcinoma； p16 protein； immunohistochemistry
P16基因是多重肿瘤的抑制基因（MTS1），位于人类染色体qp21区位上，全长为8.5kb,其编码分子量为15.84kD的蛋白质P16，P16基因是一种CDKS抑制蛋白基因，其表达蛋白通过与CDK4的特异的结合来抑制该蛋白激活酶的活性，阻止细胞从G1期到S期，从而抑制细胞增殖［1］。当其发生突变或缺失时，调控细胞周期的抑制因子P16不能正常表达，导致细胞增殖失控，而发生肿瘤形成［2］。本文探讨其P16蛋白表达与胆囊肿瘤的发生、发展关系及临床病理特征。
1 材料与方法
1．1 材料
由上海市瑞金医院集团闵行医院病理科提供2001年1月～2005年12月外科手术存档蜡块标本，胆囊癌46例，其中乳头状腺癌16例，管状腺癌24例，粘液腺癌6例。胆囊腺瘤20例。对照组胆囊正常黏膜24例。所有病例均经HE染色病理诊断证实。
1．2 方法
石蜡存档标本分别切片，厚4μm,分别作免疫组化既用型二步法染色。用已知的阳性切片作阳性对照。P16蛋白的阳性表达定位于细胞浆或细胞核内呈棕黄色颗粒。阳性细胞数的细胞核或浆有棕色＜25%及无着色为（-）；阳性细胞数在25%～50%为（+）；阳性细胞数＞50%为（++）。
1.3 统计学方法
统计学处理采用卡方及秩和检验。
2 结果
2．1 P16蛋白的表达与胆囊良恶性病变中的关系
见表1。P16蛋白在胆囊癌组中阳性表达率53.0%（24/46），与胆囊良性病变组的比较差异有显著性（P＜0.05），而胆囊腺瘤组与胆囊正常黏膜间的阳性率差异无显著性（P>0.05）。表1 P16蛋白表达与胆囊良恶性病变关系（略）注：与胆囊黏膜组比较，P＜0.05，△P＞0.05
2．2 P16蛋白的表达与胆囊癌病理分型及分化程度的关系
见表2，P16蛋白在胆囊粘液腺癌中阳性表达34.0%(2／6),与胆囊管状腺癌组和乳头状腺癌组比较有明显差异性(P＜0.05)。在低分化癌组的阳性表达比高、中分化癌组低，差异均有显著性（P＜0.05），提示P16蛋白表达与胆囊癌组织学类型的恶性程度及分化程度相关。表2 P16蛋白表达与癌病理分型及分化程度的关系（略）注：P＜0.05
2．3 P16蛋白的表达与Nevin［3］分期的关系
P16蛋白的表达在胆囊癌S4～S5期中阳性表达29.0%（4/14），与S3期和S1～S2期间均有差异性，提示了P16蛋白表达在胆囊癌的病程晚期表达率更低（P＜0.05），见表3。表3 P16蛋白表达与Nevin分期的关系（略）注：P<0.05
3 讨论
肿瘤的发生发展是一个复杂的多阶段过程，多种基因和多种分子水平变化与之密切相关。不仅同细胞程序性凋亡及肿瘤的发生、发展、浸润、转移等有密切相关，同时也参与细胞间的信息传递，或成为细胞内的第二信使，并行使辅助分子功能，将细胞外信息传至细胞质及细胞核，调控基因表达。
胆囊癌占整个消化系统恶性肿瘤的第五位，与肝外胆管癌相比其临床症状相对稳袭，多表现为腹胀、嗳气等一般消化症状，腹痛黄疸少见，不易及早发现，且转移发生早，故预后差。与预后有关的因素目前已知的有临床分期、手术切缘、组织学分级、DNA含量的测定及多种癌基因异常表达等［4］密切相关。
P16基因是Serrano［5］、Kamb［6］首次报道的一种新型肿瘤抑癌基因，其完整编码序列包括2个内含子（intron1和intron2）和3个外显子，其中5′端126bp区域为外显子1（exon1）中间307bp为外显子2（exon2）,3端11bp区域为外显子3（exon3）［5］。P16抑癌基因由3个外显子组成，编码为156个氨基酸，其作用越来越受人们的重视，它与多种恶性肿瘤的发生、发展有关，故称为多重肿瘤抑制基因（MTS1），已被国际基因组织命名为（DKN2）基因［6，7］。Kamb等研究发现人类的多种肿瘤及其转化细胞系均存在较高频率的P16基因缺失。有研究报道［8］，把野生型P16基因转换给P16基因缺失的肿瘤细胞系时肿瘤生长明显受抑。另外，大量文献报道P16在G1期与Cyclin D、CDK4或CDK6以及PRB共同形成反馈环调节细胞周期的运转。CDK4或CDK6与Cyclin D结合而被激活继而磷酸化PRB，从而激活转录因子E2F促使S期特殊的基因表达［9］。P16与Cyclin 竞争结合CDK4和CDK6，抑制CDK4和CDK6的活化，使细胞停滞于G1期［10］，从而抑制细胞增生和恶性转化。当P16基因缺乏或突变而不能正常表达时，细胞则失去控制发生癌变［5］。这种抑癌基因的突变或缺乏，并且广泛存在于各种消化系肿瘤中，在食管癌、胃癌、胰腺癌等肿瘤中都检测到P16基因的高频突变及缺乏［11，12］，在原发性胆管癌中发现P16基因突变为63%，突变率较P53（1/16）和Kras基因（1/25）高［13］。提示在消化系肿瘤的发生、发展中P16基因的纯合子缺失比基因突变发挥了更重要的作用［11，12］。
实验结果显示，P16蛋白的表达主要位于胆道系统及其肿瘤细胞核和细胞浆，少部分发现仅有细胞浆着色而核未着色，这与P16蛋白在食管癌、胃癌、胰腺癌细胞着色情况相一致。本组的胆囊腺瘤和胆囊正常黏膜组中P16蛋白均有较高的阳性率，而二者间的P16蛋白阳性率比较差异无显著性。在胆囊癌组中S1～S2期的P16蛋白表达无明显下降，直至S4～S5期方明显下降。由此提示P16基因突变与失活，并不是发生于胆囊癌的早期。而是发生在胆囊癌的中晚期。在胆囊癌组中P16蛋白的阳性率明显低于胆囊腺瘤与正常黏膜组的阳性率（P＜0.05）。发生在胆囊外转移，例如肝转移时的S4～S5期P16蛋白阳性表达率低于未发生转移的S1～S2期及良性病变黏膜组，统计学上差异均有显著（P＜0.05），表明P16蛋白的低表达与胆囊癌的发生和发展密切相关。说明P16基因的失活是胆囊癌细胞因失控而加速，尤其在肿瘤发生晚期的这种机制更明显，故P16基因可为肿瘤进展的重要指标之一。结果还显示，在低分化胆囊癌组P16蛋白表达显著低于高、中分化癌组（P＜0.05），提示了P16阳性表达与胆囊癌的恶性程度及分化相关，可作为胆囊癌的预后判断指标之一。
P16基因在许多肿瘤研究中已得到证实。国外研究报道显示：P16基因突变可能与Nsclc病例的临床分期有关。国内有报道：P16基因突变与Nsclc的发生发展可能有一定的关系，且与发生在晚期及转移有关［1］。显然对胆囊癌中P16基因蛋白的表达，可为临床诊断及预后判断提供一个有效手段的指标依据。
【参考文献】
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12 吕有勇，高崇峰，崔建涛，等.胃癌中MTS1/P16基因缺乏及表达异常的研究.中华肿瘤杂志，1996，18：189-191.
13 Majima T. Cancer Lett,1997,118(1):47-53.
作者单位： 1 201100 上海，上海市闵行区吴泾医院病理科
2 201100 上海，上海市瑞金医院集团闵行医院病理科(通迅作者)