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【摘要】 热疗作为治疗肿瘤的一种重要手段目前已越来越引起人们的关注，本文就肿瘤热疗所涉及到的生物学机制如肿瘤血管血供、ph值、肿瘤细胞形态、细胞凋亡、细胞周期、机体免疫及HSP、P53、Bcl-2分子等方面的改变作一简要综述。
【关键词】 热疗； 细胞凋亡； 免疫； HSP
自从1866年德国医生Busch首先报道1例经病理证实的面部肉瘤，因2次高热感染丹毒后肿瘤消失病人存活以来，有关热疗治疗肿瘤的报道屡见不鲜，尤其是在过去的20年间，随着基础研究的深入，热疗这一古老的疗法得到了迅速发展，目前肿瘤热疗在临床上已得到较广泛的应用，并显出良好的疗效［1，2］，人们对热疗的生物学机制也有了更深入的认识。本文就此作一综述。
1 热疗对肿瘤细胞的直接杀伤作用
1.1 细胞膜及细胞骨架破坏
细胞膜是热疗的靶器官，受热后细胞膜的流动性和通透性增加，导致细胞内环境发生变化以及妨碍经膜转运蛋白和细胞表面受体的功能，而且肿瘤细胞膜的胆固醇含量较正常细胞低，膜流动性较强，故对热疗更为敏感。热疗还可导致细胞骨架损伤，引起细胞内Ca2＋浓度升高，主要表现为对细胞形态、有丝分裂器、细胞核及其核仁等的破坏。
1.2 细胞器功能受损
高热时，许多细胞器功能受损，如线粒体结构破坏、粗面内质网脱颗粒，溶酶体活性升高，影响了肿瘤细胞内的代谢，使细胞内呼吸受抑制，进一步促细胞死亡。
1.3 细胞蛋白及核酸合成受抑
高温能抑制肿瘤细胞的DNA、RNA的合成，使聚合酶失活、染色体畸变，在细胞死亡之前细胞内难以进行大分子的合成，故使细胞难以修复，但RNA和蛋白合成在热疗停止后可较快的恢复，DNA合成则长时间受抑制［3］。热疗还可损伤与DNA结合的染色体蛋白，引起核基质内变性蛋白的聚集，进而影响了包括DNA复制、转录、修复及hnRNA处理等的分子功能。
1.4 诱导肿瘤细胞凋亡
热疗可通过以上所述的细胞毒作用，并通过加强凋亡相关基因的表达，以p53依赖和非依赖方式诱导细胞凋亡。大量体外实验证明，42℃～45℃高温可促使多种肿瘤细胞凋亡［4］。Takau等研究发现热疗诱导细胞凋亡的出现总是伴随Ｇ1期细胞下降，故推测热疗诱导的肿瘤细胞凋亡出现在细胞周期的Ｇ1期。
1.5 细胞周期阻滞
多项研究示热疗可引起细胞周期阻滞［5，6］，热疗后DNA聚合酶解聚，使DNA和RNA合成受抑，核分裂减少，同时热疗可诱导野生型p53、p21等的表达，进一步抑制多种周期素一细胞周期依赖激酶复合物的激酶活性，从而引起G1期阻滞，抑制细胞周期进展。
2 热疗对肿瘤细胞的间接杀伤作用
2.1 对肿瘤血管血流影响
肿瘤内的血管、血流与正常组织显著不同，有以下特点［7］：(1)血管丰富，但形态异常，血管扭曲杂乱，血流阻力大，随着肿瘤的增大，血管受压，容易形成血栓和闭塞。肿瘤生长速度大于血管增生速度，导致肿瘤中心组织缺血坏死。(2)肿瘤组织的毛细血管壁由单层内皮细胞和缺乏弹性基膜的外膜组成，在高热、压力增高的情况下脆弱易破裂。(3)血管内皮细胞间隙大，部分由肿瘤细胞衬覆，细胞增生向管腔内突起引起阻塞。(4)肿瘤毛细血管具有很多血窦，在常温下就处于开放状态，温度升高后血流并没有明显增加。(5)肿瘤血管神经感受器不健全，血管对热感受性差。上述特点致使肿瘤血流速度缓慢，血流量低，常为邻近正常组织的10％左右，热疗时正常组织有良好的血液循环，并能充分散热，温度升高不显著；而肿瘤组织则散热困难，热量聚集，致使温度显著升高。研究证实肿瘤组织的温度可以高于正常组织5℃～10℃，而且肿瘤中心的温度高于其周边的温度，不均匀度达1℃～15℃以上，保证了局部高热能杀灭肿瘤细胞，而且热疗后肿瘤组织血供更加减少导致氧分压进一步降低，严重影响了肿瘤组织的正常代谢，导致酸性产物大量蓄积，肿瘤内pH值降低。而低氧、低营养和低pH状态是增加细胞对热敏感的良好环境，使肿瘤细胞更易被杀灭［9］。
另外，热疗可抑制肿瘤源性的血管内皮生长因子(VEGF)及其产物的表达，从而阻碍肿瘤血管内皮增生及细胞外基质的再塑形，抑制肿瘤生长及转移。Sawaji等［8］对体外培养的HT-1080细胞在42℃加热4 h并在37℃孵育24 h后，发现VEGF(VEGFl21、VEGFl68、VEGFl89)及其产物均下降。另外对肿瘤病人进行42℃的全身热疗，发现血清VEGF亦下降。
2.2 对pH值影响
高温抑制了肿瘤细胞的呼吸，导致无氧糖酵解增加而使乳酸浓度增加，致pH降低，pH降低促进溶酶体数量增多、活性升高，从而加速肿瘤细胞的自我消化和死亡过程。pH降低又使琥珀酸脱氢酶(SDH)、DNA聚合酶b、DNA修复酶等酶系活性降低，进而抑制DNA、RNA和蛋白合成，同时也使细胞膜结构不稳定，小分子蛋白外溢，最后导致癌细胞凋亡或死亡。同时研究也发现，低pH环境有助于热疗引发的癌细胞凋亡和对癌细胞周期的干扰，有明显增加热疗杀灭癌细胞的作用［9］，使其更不耐受高温，它最显著的增敏温度为42℃～42.5℃。活体肿瘤比体外肿瘤敏感，大肿瘤较小肿瘤敏感，肿瘤中心较肿瘤周边敏感。Engin K等研究示pH值与肿瘤的完全缓解率(CR)呈显著负相关：pH值介于6.00～6.80时，CR=100%；pH值介于7.21～7.52时，CR=50%，P=0.002。Toshio等［10］用耐酸的人上颌部癌细胞 (IMC-3-PH)，在pH值6.8时，44℃加热后48h测定，癌细胞凋亡增加约54％；而在pH值7.4时为24％。
2.3 对机体免疫的影响
研究显示热疗能激发机体免疫，引起自身抗肿瘤作用，并抑制肿瘤的转移。即使是局部热疗，也有这样的作用，而且不论对原发灶还是对转移灶热疗均能产生免疫刺激，导致局部及远处病灶的消亡［11］，此即肿瘤热疗的异位效应(abscopal effect)。热疗可增强NK细胞、Ｔ淋巴细胞和巨噬细胞的活性及免疫能力并促进IL-6、IL-8、TNF等细胞因子的合成［12］。全身热疗（WBH）还可以促进肿瘤组织内细胞粘附分子-1(ICAM-1)的表达，增加淋巴因子活化的杀伤细胞(LAK)的反应。
热疗可能通过以下机制发挥作用：(1)局部热疗直接破坏肿瘤组织，消除了体内肿瘤细胞产生的多种免疫抑制因子(如封闭因子、巨噬细胞移动抑制因子等)的来源，使机体恢复对肿瘤的免疫应答反应；(2)热疗后肿瘤细胞变性、坏死的分解产物被机体吸收，作为一种抗原刺激机体的免疫系统产生抗肿瘤免疫；(3)局部热疗是一种物理性损伤因素，会引起非特异性炎症反应，炎症反应可通过IL-1等可溶性细胞因子诱导免疫反应；(4)肿瘤的免疫原性低下是肿瘤免疫逃逸的原因之一。研究表明热疗不会使靶区内所有抗原消失，且高温能够增加膜脂流动性，使细胞膜脂质中的抗原流动性增加，积聚在细胞膜表面，有利于抗体、补体与抗原结合。高温也能阻止抗原抗体复合物脱落，使免疫效应对靶细胞发挥细胞毒作用；(5)细胞表面负电荷高是癌细胞的重要特性之一。癌细胞表面负电荷的增加，可导致细胞接触抑制消失，从而促进癌细胞的增殖和转移。适度的加温可使癌细胞表面负电荷不可逆降低，能使癌细胞增殖减慢，转移减少，并且有助于免疫细胞接触而吞噬癌细胞；(6)还有学者认为热疗可以刺激细胞因子的生成，通过细胞因子网络的调节作用，增强机体免疫力。近年来研究发现热疗不仅可以使肿瘤细胞凋亡，而且促使肿瘤细胞产生大量的HSP，而HSP又与提高机体的免疫功能密切相关［13］（具体见HSP中所述）。总之，热疗改变了肿瘤细胞的免疫原性，使机体的监视系统得以认识，改变了抗原性的肿瘤细胞，从而引发免疫反应，起到杀伤肿瘤的作用。
3 热疗的分子机制
3.1 HSP 热休克蛋白(HSP)在细胞生长、发育、分化、基因转录等功能方面发挥重要作用。与多种蛋白质形成复合体，并通过其结合和解离参与靶蛋白的折叠、亚基间装配、跨膜转运及降解，以调节靶蛋白的活性和功能。故又被称为是“伴侣蛋白”。根据同源程度及分子量大小可分为HSPll0、HSPg90、HSP70、HSP60、小分子HSP及泛素等几个家族。研究表明HSP具有抗肿瘤活性，与以下免疫机制有关［14］：(1)HSP70与肿瘤细胞内的特异性抗原肽结合形成多肽复合物，通过抗原提呈细胞(树突状细胞、巨噬细胞)表面的特异性高亲和受体，介导抗原肽进入抗原提呈细胞，而抗原肽与胞内MHC分子形成复合物，并在抗原提呈细胞（APC）表面呈现，被αβT细胞识别，激发抗肿瘤细胞特异性反应； HSP70还可以促进Th细胞向Thl细胞转化，调整肿瘤患者机体的免疫状态；(2)通过激活CTL(CD8+)细胞杀伤肿瘤细胞；(3)NK细胞无需致敏、补体激活和抗原诱导，可以通过识别MHC类样分子(如HSP70家族蛋白)而发挥作用。对肿瘤细胞应激处理后的一些体外细胞毒试验发现NK细胞可以通过细胞毒性作用杀伤一些肿瘤细胞；(4)γδT细胞对肿瘤细胞的杀伤效应可以不受MHC分子的限制性。HSP70可作为抗原递呈分子，将肿瘤抗原呈递到细胞表面，使γδT细胞活化，从而发挥杀伤细胞效应；(5)通过诱导PBMCs和γδT细胞产生多种细胞因子（如TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-8、IFN-γ）达到抑制肿瘤细胞生长及杀伤肿瘤细胞的目的；(6)HSP70还可以活化补体系统，发挥抗肿瘤的作用。目前，通过肿瘤组织提取或基因工程生产的HSP70-抗原肽复合物，作为疫苗免疫机体而激发机体产生抗肿瘤免疫的方法在动物试验和临床中都已开展，并取得了一定进展，使动物的存活期明显延长，并使肿瘤患者体内产生抗肿瘤免疫［15］。
HSP具有保护细胞免受热疗的细胞毒作用。HSP与HSF (heat shock factor)形成复合物，加热下HSP从HSP/HSF复合物分离，与热变性蛋白结合，起保护作用。另外HSP可影响TNF、高热引起的JNK (c-jun激酶)凋亡信息通路的激活，HSP的高表达，使SPAK/JNK活化抑制，主要为阻断下游信息的传递；另外wt p53包含一个HSP结合域，HSP的上调可抑制p53的功能，从而减少凋亡［16］。
第1次加热后引起细胞对后继加热产生的抗拒现象称为热耐受性。热耐受是热疗中普遍存在的生物现象。HSP与热耐受密切相关，增强肿瘤细胞内HSPs的表达，细胞对热疗的敏感性下降；反之，下调细胞内HSPs的表达，则可提高热敏感性。HSP可能通过发挥其分子伴侣、抗氧化、抗凋亡、协同免疫作用来诱导热耐受［17］。
3.2 Cp53
p53与热诱导的肿瘤细胞调亡密切相关。野生型p53 (wt p53)的肿瘤细胞比缺失或突变型p53的热敏性高，wt p53的表达可增加20％的肿瘤热敏感性，所以p53状态是热敏感性的一个决定性因素［18］，为影响热诱导肿瘤细胞凋亡的主要因子。热疗后，经p53信号传导，激活Caspase-3，经过一系列链级反应，Caspase家族相继激活，后者再激活CAD (caspase-act ive Dnase)，它为诱导凋亡的最后效应子，引起PARP (多聚核糖ADP聚合酶)、核肌层蛋白、肌动蛋白等蛋白的分解、DNA分解，最后致肿瘤细胞凋亡。p53还可通过调节其下游基因如Bax、Fas/Apol-1和PAG608 (p53 associate gene 608，编码核锌脂蛋白)等，使它们在热疗后表达上调，从而促进肿瘤细胞凋亡的增加［19］。
另外wt p53在热疗引起的细胞周期阻滞中也发挥了重要作用。p53蛋白控制着细胞周期的重要检查点G1期，当热疗致肿瘤细胞DNA损伤后，野生型p53（wtp53）被激活，而作为p53下游的靶分子，p21Waf1启动子上有p53的结合位点，则p53作为转录因子启动p21Waf1的表达，使细胞周期停滞于G1期。另外p53能结合特殊DNA序列-基因启动区域，从而调节WAF1表达(wild-type p53 active fragment l)，它是一种重要的正性调节p53依赖的G1期阻滞的因子，热疗可诱导WAF1基因的表达，使WAF1增加，并增加p53与WAF1上游的特异性结合位点p53con的结合活性，激活其表达，它结合并抑制多种周期素－细胞周期依赖激酶复合物的激酶活性，抑制其底物的磷酸化，从而引起G1期阻滞，抑制细胞周期进展。
3.3 bcl-家族
bcl-2基因家族作用于各种凋亡途径共同的最后通道，调控细胞凋亡，在热疗引起的肿瘤细胞凋亡中发挥重要作用［20］。bcl-2及bax可能通过以下途径调节热诱导的肿瘤细胞凋亡的发生：(1) bcl-2与bax可行成异源二聚体，当细胞中bax高表达时形成bax同源二聚体，加速细胞凋亡，反之，bcl-2高表达时，形成bcl-2同源二聚体，抑制细胞凋亡。热疗后，bcl-2几乎未变或轻度下降，而bax增加，产生bax／bax同源二聚体，引起凋亡增加。(2)bcl-2与Apaf-1结合，抑制Apaf-1与半胱氨酸天冬氨酸酶前体的结合，阻止酶活化及凋亡发生。而当细胞接受热疗后，促凋亡蛋白bax能将Apaf-1从死亡抑制蛋白bcl-2上游离下来，参与半胱氨酸天冬氨酸酶的活化，促凋亡的发生。(3)细胞凋亡过程中，细胞色素C释放致胞浆内，加速Apaf-1结构的改变，使之与半胱氨酸天冬氨酸酶前体结合并激活之。高表达bcl-2能阻止细胞色素C从线粒体上释放致胞浆内并可抑制线粒体膜的去极化和膜损伤发生。而热疗后bax蛋白高表达则能促进线粒体通透性改变或在线粒体外膜上打孔诱发细胞凋亡。(4)热诱导细胞凋亡中核酸内切酶的活化可能依赖于胞内Ca2＋，bax通过升高细胞器膜通透性，促进Ca2＋外流调节细胞凋亡的发生。(5)bax为p53依赖性凋亡的下游物质，热疗后，p53上调与bax上游的p53con结合，激活Bax使其增加而促使肿瘤细胞凋亡［19］。
3.4 其他相关基因
c-fos基因为细胞原癌基因，其产物本身是核内转录因子，可引起肿瘤增殖。多项研究显示在发热的早期，就伴有c-fos的表达［21］。在Burkitt淋巴瘤中，热诱导的凋亡伴有c-fos mRNA升高，43℃加热30min后6h测定，60％的肿瘤细胞出现凋亡，如加热与稳定状态的c-fos mRNA表达联合运用，可增加10倍凋亡作用，c-fos mRNA可上调热诱导的凋亡作用［22］。在成熟胞浆的c-fos mRNA半衰期为9min，热疗后它的非翻译区的富含A+U序列的保留区与短期 (short-live)蛋白相互作用，不稳定替代或移去非翻译区的3’部分，可延长c-fos mRNA半衰期。由于稳定的c-fos mRNA水平增加，则c-fos蛋白表达增加，其在核内出现，参与热诱导凋亡［22］。
目前研究表明，Mts1基因是一种转移相关基因，在鼠和人的肿瘤中，Mts1的高表达与肿瘤的侵袭、转移相关。Albertazzi等研究认为，加热可下调转移相关Mts1基因在鼠BL6-B16黑素瘤细胞中的表达。研究表明，加热还可下调耐热的变异鼠BL6-B16细胞株和变异人HepG2肝癌细胞株的Mts1的表达，笔者推测Mts1、HSP28和p53三者形成一调节环，互相作用，共同影响肿瘤的转移［23］。
3.5 过氧化物
热疗时超氧化物及自由基的形成可能是热疗致肿瘤细胞死亡的另一重要原因。过氧化物与脂质过氧化的增加程度与肿瘤的凋亡相平行，并明显降低肿瘤生长。热疗产生的ROS (reative oxygen species)为低分子铁复合物，易引起脂质过氧化。ROS可激活NFKB (细胞核因子K B)、TNF-α的表达，从而增加凋亡。ROS还可引起线粒体膜电位变化，cytC从线粒体膜释放入胞质，Caspase酶原入胞质并激活，引起肿瘤细胞凋亡。SOD (过氧化物歧化酶)的mRNA水平与肿瘤的侵袭性明显相关，其抑制剂可增加热诱导的凋亡作用［24］。
3.6 胞外基质降解酶
细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)是肿瘤细胞在转移中面临的第一道屏障。肿瘤细胞可产生大量的蛋白水解酶降解细胞外基质，使肿瘤细胞易于迁移。主要的降解酶包括：尿激酶型纤溶酶原激活物(Urokinase-type plasminogen activator，UPA)系统、基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinase，MMP)家族。Fukao等观察人纤维肉瘤HT-1080、高转移肺腺癌HAL-8、恶性黑素瘤Bowes及骨肉瘤NY细胞株在热处理(43℃、120min)后的生存率和蛋白水解作用，结果表明加热明显降低了对热耐受强的ＨT-1080、HAL-8细胞的UPA受体表达，从而减少UPA在细胞表面的结合位点，减弱蛋白水解，抑制肿瘤细胞的浸润和转移［25］。Chen等研究显示，热疗启动CHOK1细胞的热克因子1，抑制和阻断ras信号传导途径，从而抑制ras对UPA基因启动子的激发，降低UPA的表达。
MMP是另一类重要的蛋白水解酶。Sato报道［26］，人纤维肉瘤HT-1080细胞株42℃加热，可以从基因转录水平抑制膜型1-MMP的产生，并抑制其对胶原酶前体的激活。在加热后的人上皮细胞鳞癌A431细胞株及人口腔鳞癌SAS细胞株也观察到相似的结果。提示热疗在抑制肿瘤生长的同时，也有抗肿瘤侵袭、转移的作用。笔者还认为加热是通过暂时性增加细胞内的cAMP表达而抑制膜型1MMP的产生和胶原酶前体的激活。
4 问题与展望
热疗作为一种新疗法，在临床上已得到相当广泛的应用并显示出良好效果，但是当前有关热疗的确切的生物学机制尚研究的不透彻，文献中也常有不一致的结论。但相信随着热疗工程学及热疗生物学的不断发展完善，热疗在肿瘤综合治疗中的作用将进一步增强，而新的肿瘤治疗方法如基因及免疫治疗与热疗结合将为肿瘤治疗开辟新的领域。
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作者单位： 200080 上海，上海交通大学附属第一人民医院消化科