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【摘要】 目的 卵母细胞孤雌激活是胚胎体外生产的一项重要技术。本试验通过乙醇、离子霉素和6-DMAP不同浓度和不同激活时间的优化组合，提高孤雌激活效果和孤雌胚发育能力。方法与结果 试验1，体外成熟的卵母细胞经5 M离子霉素或7%的乙醇激活5min，然后在6-DMAP中激活4h，6-DMAP的浓度设置为0.5mM、1.0mM、2.0mM和3.0 mM；结果表明，浓度为2.0mM 和 3.0mM 6-DMAP激活的卵母细胞卵裂率（37.50%）显著高于其他各组（P＜0.01）。试验2，体外成熟的卵母细胞经5 M离子霉素激活5min，然后在2.0mM 6-DMAP中激活1h、3h、5h、7h和9h；结果表明，卵母细胞在6-DMAP中激活5h和7h其囊胚率（12.38% 和 10.48%）显著高于其他各组（P＜0.01）。结论 本研究认为Ionomycin和乙醇为激活剂时，6-DMAP的孵育时间以5h为宜。Ionomycin比乙醇激活效果好，但乙醇与Ionomycin简单便捷。
【关键词】 羊；卵母细胞；孤雌激活
The study on parthenogenetic activation of sheep oocytes
ZHANG Jian-xin, YUE Wen-bin, REN You-she,et al. College of Animal Science and Technology, Shanxi Agricultural University，Taigu Shanxi 030801,China
【Abstract】 Parthenogenetic activation of oocytes was important technology of embyos production in vitro. This experiment was undertaken to improve development of parthenogenetic embryos following various combined treatments of ethanol, ionomycin, and 6-DMAP. In Experiment 1, in vitro matured oocytes were treated with 5 M ionomycin or 7% ethanol for 5min followed by incubation in 6-DMAP for 4h, which concentration was 0.5 mM, 1.0 mM, 2.0 mM and 3.0 mM; The result shows that the cleavage rates (37.50%) of the 2.0 mM and 3.0 mM 6-DMAP groups were significantly higher than the other groups (P＜0.01). In Experiment 2, in vitro matured oocytes were treated with 5 M ionomycin for 5min followed by incubation in 2.0 mM 6-DMAP for 1h, 3h, 5h, 7h or 9h;The result shows that the blastoeyst rates (12.38% and 10.48%) of the 5h and 7h groups were significantly higher than the other groups (P＜0.01).
【Key words】 sheep; oocytes; parthenogenetic activation
卵母细胞体外受精和孤雌激活是胚胎工程研究领域获得胚胎的两条重要途径， 卵母细胞正常受精时， 精子与卵子质膜直接融合或通过表面上的受体蛋白引起卵内Ca2+浓度的瞬时升高， 由此引起包括皮质颗粒（CG）释放、 细胞质内pH的改变、 母源mRNA的补充等一系列激活反应， 最终导致原核的形成、 DNA合成的起始和卵裂；卵母细胞孤雌激活是一种人工激活卵的方式， 通过电脉冲、 Ionomycin、 乙醇、 钙离子载体、放线菌酮和1, 4, 5-三磷酸肌醇（IP3）等都可以引起卵母细胞的激活， 使MII期卵母细胞不经过受精过程完成早期胚胎发育， 获 得孤雌胚胎。
孤雌激活与体外受精都是以MII期卵母细胞为起点，都能获得早期胚胎，但孤雌激活与体外受精存在本质的区别；前者是人工活化卵母细胞，后者是自然活化卵母细胞；孤雌激活胚是通过抑制第二极体排放，使其与原来的卵母细胞核融合构成二倍体的胚胎，而体外受精胚胎是由雌雄配子融合所获得的胚胎，孤雌激活和体外受精是两项相对 独立的技术但又有密切的联系。
目前大部分哺乳动物体外受精产生胚胎的发育率和妊娠率都比较低，但有试管动物相继诞生；孤雌生殖的动物个体仅获得早期胚胎，还没有妊娠成功的报道。本研究针对影响孤雌激活的主要因素，比较了Ionomycin、乙醇与6- DMAP对成熟卵母细胞的激活效果，旨在建立一套快速、便捷的卵母细胞体外激活方法，提高孤雌激活的效果与可操作性。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 主要仪器 体视显微镜：日本NICON，SMZ800-C-EPI；CO2培养箱：美国，Forma scientific 3336型；双人单面垂直流超净台：上海，ZHJH-1115。
1.1.2 试剂与耗材 一次性塑料培养皿为Nunclon公司产品；培养用TCM199和胎牛血清（FBS）由Gibco公司生产，其他所有化学试剂除特别指明外，均为Sigma公司生产；FSH、LH和17 -E2购自宁波激素制品公司。
1.1.3 操作液
1.1.3.1 卵母细胞成熟液 TCM-199，HEPES 10mM，丙酮酸钠0.38mM，FBS 10%，17 -E2 1g/ml，LH 20g/ml，FSH 10μg/ml，青霉素100U/ml，硫酸链霉素100U/ml。
1.1.3.2 胚胎培养液 SOFaa胚胎培养液为基础液，另加HEPES 10 mM，5% FBS，EDTA 0.1 mM，青霉素100U/ml，硫酸链霉素100U/ml。
1.2 实验方法
1.2.1 卵母细胞成熟与孤雌激活前处理 卵母细胞采集后成熟培养23～24h后，去除卵母细胞外的所有卵丘细胞，挑选明显具有第一极体的成熟卵母细胞进行孤雌激活试验。
1.2.2 孤雌胚体外培养 各种处理后的卵母细胞放入预先制备好的颗粒细胞单层的胚胎培养液微滴内进行共培养，每48h半量换液1次。
1.2.3 实验设计与结果统计 本研究针对用于卵母细胞孤雌激活的两种常用方法，比较了Ionomycin、乙醇与6-DMAP不同浓度组合对卵母细胞激活效果的影响，试验设计具体如下。
实验1：Ionomycin与不同浓度6-DMAP联合对卵母细胞激活效果的影响。
选择成熟良好且去除卵丘细胞的卵母细胞，在含5μM Ionomycin的胚胎培养液内激活5min，用胚胎培养液洗3次后，移入含有0.5mM、1.0mM、2.0mM和3.0mM 6-DMAP的胚胎培养液内培养4h，然后用无Ionomycin和6-DMAP的胚胎培养液洗涤3次，移入正常胚胎培养液中培养，于培养后24h检查卵裂率。
实验2：乙醇与不同浓度6-DMAP联合对卵母细胞激活效果的影响。
选择成熟良好且去除卵丘细胞的卵母细胞，在含7%乙醇的胚胎培养液内激活5min，用培养液洗3次后，移入含有0.5mM、1.0mM、2.0mM和3.0mM 6-DMAP的胚胎培养液内培养4h，然后用无乙醇和6-DMAP的胚胎培养液洗涤3次，移入正常胚胎培养液中培养，分别于培养后24h检查卵裂率。
实验3：6-DMAP不同处理时间对卵母细胞激活效果的影响。
以以上实验为基础，在Ionomycin和乙醇最佳激活浓度下，比较6-DMAP不同处理时间对卵母细胞激活效果的影响。
以上所有实验重复5批，每批重复卵母细胞同批采样、同批成熟、同皿分区50μl微滴培养，同一处理的卵母细胞在同一个微滴中培养，每个微滴中卵母细胞数量相等。
实验数据采用邓肯法多重均值比较，SAS统计软件统计分析。
2 实验结果
2.1 Ionomycin与不同浓度6-DMAP联合对卵母细胞激活效果的影响 Ionomycin与不同浓度6-DMAP联合对卵母细胞激活见表1。
表1 Ionomycin与不同浓度6-DMAP对卵母细胞激活效果的影响 略
由表1的统计结果可以看出，I组、II组、III组和IV组的卵裂率分别是26.36%、32.73%、40.91%和37.27%，从I组～III组随6-DMAP浓度增大，卵母细胞孤雌激活的卵裂率显著增加（P＜0.01），III组和IV组的卵裂率差异不显著（P＞0.01），Ionomycin与6-DMAP联合作用激活卵母细胞6-DMAP的浓度以2.0mM为宜。
2.2 乙醇与不同浓度6-DMAP联合对卵母细胞激活效果的影响 乙醇与不同浓度6-DMAP联合对卵母细胞激活效果见表2。
表2 乙醇与不同浓度6-DMAP对卵母细胞激活效果的影响 略
由表2的统计结果可以看出，I组、II组、III组和IV组的卵裂率分别是19.79%、27.08%、39.58%和37.50%，从I组～III组随6-DMAP浓度增大，卵母细胞孤雌激活的卵裂率显著增加（P＜0.01），III组和IV组的卵裂率差异无显著性（P＞0.01），7%的乙醇与6-DMAP联合作用激活卵母细胞6-DMAP的浓度也是以2.0 mM为宜。
综合比较表1、表2结果， Ionomycin对卵母细胞激活效果显著强于乙醇。
2.3 6-DMAP不同处理时间对卵母细胞激活效果的影响 6-DMAP不同处理时间对卵母细胞激活效果见表3。
表3 6-DMAP不同处理时间对卵母细胞激活效果的影响 略
由表3的统计结果可以看出，成熟卵母细胞用6-DMAP孵育1h、3h卵裂率分别为20.00%和36.19%，显著低于激活5h（45.71%）、7h（48.57%）和9h（46.67%）三组（P<0.01）；5h、7h和9h三组之间差异无显著性（P＞0.05）。
成熟卵母细胞用6-DMAP孵育1h不能发育到囊胚；孵育3h囊胚率为5.71%，显著低于激活5h（12.38%）、7h（10.48%）和9h（7.62%）三组（P<0.01）；孵育5h和7h的囊胚率差异无显著性（P＞0.05），但显著高于孵育9h组（P<0.05）。
由此可见，在一定范围内（7h）成熟卵母细胞的卵裂率随与6-DMAP孵育时间延长而提高，时间低于3h卵裂率很低，高于7h卵裂率不再提高；对于囊胚率而言，与6-DMAP孵育时间太短不能发育到囊胚，高于5h囊胚率下降，因此卵母细胞激活后在6-DMAP中的孵育时间以5h左右为宜。
3 讨论
3.1 Ionomycin与不同浓度6-DMAP联合对卵母细胞激活效果的影响 Ionomycin 是一种高效Ca2+载体，对卵母细胞激活非常有效，目前在哺乳动物卵母细胞的激活中得到广泛应用［1］。Ionomycin激活卵母细胞并不直接引起Ca2+的跨膜转运，而是动员细胞内的Ca2+，依次触发Ca2+内流［2］，激活的卵母细胞无原核形成，但有关研究证明Ionomycin与蛋白质磷酸化抑制剂6-DMAP联合作用可以有效的提高原核形成率［3］，卵母细胞用Ionomycin处理后立即用6-DMAP处理，可以得到高比例的原核形成率（76%）和囊胚发育率（21%）。
6-DMAP阻止蛋白质的磷酸化，抑制促成熟因子（MPF）和细胞静止因子（CSF）的活性，阻止第二极体的排放，MPF活性的下降导致卵母细胞减数分裂的恢复，从而激活卵母细胞［4］。
本实验比较了6-DMAP 在0.5mM、1.0mM、2.0mM和3.0mM下对羊孤雌激活卵母细胞卵裂率的影响，结果表明，用Ionomycin激活的卵母细胞，在2mM 6-DMAP内培养的卵母细胞的卵裂率最高，低浓度的6-DMAP由于不能彻底抑制蛋白质的磷酸化，因而不能充分激活卵母细胞。
3.2 乙醇与不同浓度6-DMAP联合对卵母细胞激活效果的影响 乙醇是一种化学激活剂，它对卵母细胞的激活主要是通过水解细胞膜上4,5-二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）产生1,4,5-三磷酸肌醇（IP3），从而诱发细胞内源Ca2+释放到细胞质，提高了细胞胞内的Ca2+浓度［5］。哺乳动物MII期卵母细胞在含有7%乙醇的培养液中培养5min，可以激活卵母细胞使其形成原核，甚至可以发育到囊胚［6］；乙醇对卵母细胞的激活无种间特异性，但在不同动物卵母细胞对乙醇激活的反应不同。
本实验比较了不同6-DMAP浓度对羊孤雌激活卵母细胞卵裂率的影响，结果表明，用7%乙醇激活的卵母细胞，同样在2mM 6-DMAP内培养的卵母细胞的卵裂率最高，这与Ionomycin激活的结果一致。
比较Ionomycin与乙醇对卵母细胞的激活效果，Ionomycin对羊卵母细胞的激活效果比乙醇好，但乙醇的适用性比Ionomycin好。
3.3 6-DMAP不同处理时间对卵母细胞激活效果的影响 无论是Ionomycin还是乙醇，一切激活剂都会影响卵母细胞染色体形成，进而影响孤雌胚后期的发育［7］，6-DMAP激活卵母细胞主要通过抑制第二极体的排放，形成二倍体原核［8］。
激活剂对卵母细胞激活的时间直接影响卵母细胞染色体的状态，从而表现为卵裂率与囊胚率的差异。Van De Velde等（1999）用6-DMAP激活小鼠卵母细胞3.5h，其卵裂率与体外受精胚的卵裂率差异不显著，激活时间延长至6.5h，孤雌胚的发育率明显下降，染色体的异常形成率明显升高［7］；由此说明6-DMAP通过阻止染色体分开和抑制第二极体排放，诱发卵母细胞活化，延长6-DMAP作用时间会造成纺锤体微管的不可逆损伤，引起异常分裂和非正常倍数的染色体的形成，从而表现为囊胚率的下降。
本试验研究结果表明，成熟卵母细胞用6-DMAP孵育1h、3h卵裂率分别为20.00%和36.19%，显著低于激活5h（45.71%）、7h（48.57%）和9h（46.67%）（P<0.01）；5h、7h和9h三组之间差异无显著性（P＞0.05）。 成熟卵母细胞用6-DMAP孵育1h不能发育到囊胚；孵育3h囊胚率为5.71%，显著低于激活5h（12.38%）、7h（10.48%）和9h（7.62%）（P<0.01）；孵育5h和7h的囊胚率差异无显著性（P＞0.05），但显著高于孵育9h组（P<0.05）。
由此可见，在一定范围内（7h）成熟卵母细胞的卵裂率随与6-DMAP孵育时间延长而提高，时间低于3h卵裂率很低，高于7h卵裂率不再提高；对于囊胚率而言，与6-DMAP孵育时间太短不能发育到囊胚，高于5h囊胚率下降，因此卵母细胞激活后在6-DMAP中的孵育时间以5h左右为宜。
4 结论
Ionomycin和乙醇都是较好的激活剂，二者与6-DMAP 协同作用激活卵母细胞时6-DMAP 的适宜浓度以2mM为宜，综合比较二者的激活效果，Ionomycin比乙醇激活效果好，但乙醇比Ionomycin简单便捷。
在卵母细胞孤雌激活过程中，6-DMAP对卵母细胞的孵育时间直接影响卵母细胞染色体的活动与状态，从而影响孤雌胚的发育，本研究认为以Ionomycin和乙醇为激活剂时，6-DMAP的孵育时间以5h为宜。
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基金项目：山西省自然基金（20021089）和青年基金（2006021037）资助项目
作者单位： 1 030801 山西太谷，山西农业大学动物科技学院
2 030001 山西太原，山西省畜禽繁育工作站
(编辑：李 木)