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【摘要】 目的 评价乙型肝炎病毒性肝炎患者血清 cccDNA 的临床检测价值。 方法 分别以分子信标PCR技术和实时荧光定量PCR技术检测58例急性乙型肝炎、87例慢性乙型肝炎、37例乙肝肝硬化和26例原发性肝癌的血清cccDNA与HBV-DNA，同时检测血清HBeAg和ALT。 结果 cccDNA 分别与血清HBeAg(χ2=9.2,P<0.05)、血清HBV-DNA升高（χ2=31.88,P<0.05）及血清ALT异常有关（χ2=13.21,P<0.05）。 结论 血清cccDNA 可能是乙肝病毒在患者体内大量复制并导致肝实质损伤的标志物之一。
【关键词】 肝炎病毒；乙型；cccDNA；血清学；谷丙转氨酶
既往认为细胞外乙肝病毒DNA是一种松弛环状的双链DNA（relaxed circular DNA,rcDNA）分子，唯在感染的肝细胞核内存在共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA,cccDNA）,是病毒持续感染久治不愈的原因［1～4］。虽然外周淋巴细胞存在HBV-DNA，然而外周血中cccDNA并不确定［1］。血清cccDNA与乙肝病毒感染临床表现的关系尚不十分清楚。我们检测了205例乙肝病毒感染临床患者血清cccDNA，现将有关资料报告如下。
1 材料与方法
1.1 标本来源 205例不同乙肝病毒感染肝病患者血清标本均来自我院2001年10月～2004年4月住院及门诊病人,男176例，女29例;年 龄20～68岁。急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎、乙肝肝硬化和原发性肝癌各55、87、37、26例。诊断符合2000年第十次全国传染病与寄生虫学会和肝病学会联合修订的病毒性肝炎防治方案。
1．2 检测方法 根据cccDNA结构的特点，参照文献［2，3］。在HBV基因组DNA缺口的上下游设计一对引物，并在负链开口的下游设计荧光分子信标探针。以PE9700基因扩增仪与DAS620微量荧光检测仪检测。取室温静置分离不超过6h新鲜血清冷冻保存。以50μl待检血清入0.5μl离心管内与等量处理液混匀100℃煮沸15min，12000转/min离心5min上清液作为扩增模板。扩增条件为：94℃3min, 94℃30s,55℃40s,72℃45s,38循环后72℃延伸3min。
1.3 统计学分析 组间差异用卡方（χ2）检验。
2 检测结果
2．1 血清cccDNA与肝功能血清生化指标的关系 149例血清cccDNA阴性HBsAg阳性患者ALT正常者30例，56例血清cccDNA阳性患者ALT全部升高，差异有显著性（χ2=13.21，P<0.01）。
2．2 血清cccDNA与HBV感染血清免疫学指标的关系 205例HBV感染者，cccDNA 阳性组HBeAg阳性率（54/56，96.4%），显著高于cccDNA阴性组（28/149，18.8%）(χ2=9.20，P<0.01)。
2．3 血清cccDNA与血清HBV-DNA的关系 205例 HBV感染患者，血清HBV-DNA 阳性145例（70.7%），cccDNA阳性56例（27.3%）。血清cccDNA阳性HBV-DNA水平均在1.0x103copies/ml以上，而HBV-DNA正常者血清cccDNA均为阴性（χ2=31.88，P<0.01）。
3 讨论
cccDNA是病毒基因组RNA转录的模板，是HBV复制的突出标志［2，4］。cccDNA主要存在于宿主细胞核中，是目前评价抗病毒疗效的“金标准”［1～5］。血液中cccDNA水平远远低于组织中 cccDNA水平［5］，检测较为困难。根据cccDNA结构的特点，在基因组DNA缺口的上下游各设计一对引物，并在负链开口的下游根据核酸碱基配对原则和荧光共振能量转移现象设计荧光分子信标探针，能准确检测血液中 cccDNA ，而非基因组DNA。结果初步显示血清cccDNA阳性患者HBeAg阳性率高，HBV-DNA 更是几乎无一例外全部升高，提示cccDNA可能与病毒复制有关；在HBV感染相关病例中，初步分析发现血清 ccc DNA与血清ALT异常有关，提示血清cccDNA 与肝病活动有关。值得进一步扩大临床观察。
【参考文献】
1 Kock J, Theilmann L, Galle P,et al.Hepatitis B virus nucleic acids associated with peripheral blood mononuclear cells do not originate from replicating virus. Hepatology， 1996，70:4567-4575.
2 He ML, Wu J, Chen Y, et al.A new and sensitive method for the quantification of HBVcccDNA by real-time PCR.Biochem Biophys Res Commun，2002，295:1102-7.
3 Chen Y , Sze J, He ML. HBVcccDNA in patients’ sera as an indicator for HBV reactivation and an early signal of liver damage. World J Gastroenterol， 2004,1(10):82-85.
4 赵可开，缪晓辉，徐文胜.乙型肝炎病毒cccDNA检测的方法与临床意义.中华肝脏病杂志，2005,13（4）：315-317.
5 TuttlemanJS,Pourcel C,Summers J. Formation of the pool of covalently closed circular DNA in hepadna virus infected cells.Cell,1986,47:451-460.
作者单位：257034 山东东营,滨洲医学院附属胜利油田中心医院