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【摘要】 目的 探讨慢性乙型肝炎（CHB）患者血清中cccDNA为肝脏损害的临床标志。方法 随机选取慢性乙型肝炎轻中度、慢性乙型肝炎重度及重型、乙肝病毒携带者各20例（所有病例HBV DNA均阳性）。使用实时荧光定量PCR法分别检测入选病例血清中cccDNA值及同时定量检测血清中HBV DNA和ALT、AST、TBIL。结果 三组之间cccDNA拷贝数分布位置不相同，存在差别（P=0.000<0.01）。60例患者血清中cccDNA值和ALT秩相关（Rs=0.612， P=0.000<0.01 ） ；cccDNA值与AST秩相关（Rs=0.632，P=0.000<0.01）；cccDNA值与TBIL秩相关（Rs=0.337, P=0.008<0.01，但Rs＜0.4）。 结论 患者血清中cccDNA为肝脏损害的标志，可作为判断肝功能损害的又一临床参数。
【关键词】 慢性乙型肝炎；cccDNA；实时荧光定量PCR；肝脏损害
Study of quantitative detection of HBV cccDNA in chronic HBV patients’ sera
CHEN Ming-fa,SUN Shui-lin.Department of Infectious Disease,The Second Affiliated Hospital of Nanchang University,Nanchang 330006,China
【Abstract】 Objective To verify the cccDNA in chronic hepatitis B patients’ sera is an signal of the liver damage.Mthods Selected randomly 20 slight and mild patients with chronic hepatitis B,20 patients with severe chronic hepatitis and 20 HBV viral carriers(all patients were HBV DNA positive).The cccDNA of the 60 invesgated patients were detected by selective real-time fluorescent quantitative PCR, HBV DNA were detected by routine PCR, and the ALT 、AST and TBILl were detected by routine method. Results There was significantly different in the quantify of three groups’cccDNA in sera(P=0.000<0.01). The serum cccDNA level of chronic hepatitis B patients was correlated with the level of ALT（Rs=0.612, P=0.000<0.01 ）, with AST（Rs=0.632, P=0.000<0.01）, with TBIL（Rs=0.337, P=0.008<0.01,but Rs<0.4）. Conclusion The cccDNA was an signal of liver damage,may be another important clinical parameter.
【Key words】 chronic hepatitis B；cccDNA；liver damage ；real-time fluorescent quantitative PCR
肝细胞核内有稳定的共价闭合环状DNA（covalently circular closed DNA, cccDNA）存在，为保持慢性感染的基础。研究发现部分患者血清中出现cccDNA，可能为肝脏损害释放至血液中［1］。笔者采用实时荧光定量PCR定量检测慢性乙肝（CHB）患者血清中cccDNA，探讨患者血清中cccDNA的临床相关意义。
1 对象与方法
1.1 研究对象 随机选取南昌市第九医院住院和门诊CHB患者或病毒携带者，所有入选患者血清中HBV DNA均为阳性，共计60例。CHB轻中度、CHB重度及重型、乙肝病毒携带者各20例。诊断符合2000年9月中华医学会传染病与寄生虫学会、肝病学分会联合修订的病毒性肝炎防治方案，全部患者均经血清免疫学检查确诊，无合并甲、丙、丁、戊型病毒性肝炎。同时排除了酒精性肝病、非酒精性脂肪肝和自身免疫性肝病等损害肝脏的原因。
1.2 标本采集与保存 患者入院次日测cccDNA水平。采静脉血5ml，检测肝功能、乙肝病毒标志物、HBV DNA定量等，另一份静脉血5ml离心后储藏于-70℃冰箱。
1.3 HBV cccDNA检测 采用实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）。用德国罗氏公司LightCycler 定量PCR仪检测，试剂盒购于蓝星生物科技开发有限公司，检测值用拷贝/ml。
1.4 统计学处理 用SPSS11.5进行统计分析，统计学方法为一般性描述统计，秩和检验，秩相关。
2 结果
2．1 CHB患者血清中cccDNA水平三组之间的比较 CHB轻中度组在发病初均能检测出cccDNA；CHB重度及重型组17例检出cccDNA，且拷贝数高，3例阴性；乙肝病毒携带者组只有1例阳性，其余均阴性。三组之间cccDNA水平分布位置不相同，差异有显著性（P=0.000＜0.01）；CHB轻中度组与乙肝病毒携带者组cccDNA水平分布位置明显不相同，差异有显著性（P=0.000＜0.01）；CHB轻重度及重型组与乙肝病毒携带者组cccDNA水平分布位置明显不相同，差异有显著性（P=0.000＜0.01）；但CHB轻中度组与CHB重度及重型组水平分布位置差异无显著性，双侧检验P=0.330，双侧确切概率P=0.341＞0.05,故CHB轻中度组与CHB重度及重型组cccDNA水平差异无显著性,见表1。表1 三组之间cccDNA水平的比较注：1组为CHB轻中度组，2组为CHB重度及重型组，3组为乙肝病毒携带者组(以上数值为log10对数值)
2.2 CHB患者血清中cccDNA水平与ALT、AST相关性分析 CHB患者血清cccDNA水平与AST（谷草转氨酶）的秩相关系数Rs=0.632,P=0.000＜0.01，可以认为CHB患者血清cccDNA水平与AST存在正相关关系；CHB患者血清cccDNA水平与ALT（谷丙转氨酶）的秩相关系数Rs=0.612,P=0.000＜0.01，可以认为CHB患者血清cccDNA水平与ALT存在正相关关系。
3 讨论
乙肝病毒复制是一种保守的机制，在转录后模板仍然完整。HBV DNA复制周期，开始于cccDNA，cccDNA转录前基因组RNA；反转录为负链DNA；再合成正链DNA；双链DNA又成熟为cccDNA，是一个连续的过程［1］。慢性乙型肝炎患者血清中HBV cccDNA以往多用Southern blot 方法进行检测，该方法是分子生物学的经典方法，但操作者的技术要求较高，且步骤繁琐，灵敏度较低［2］。近年来，也有较多文献报道用PCR技术对cccDNA进行检测［3］。He等［4］建立了实时荧光定量检测cccDNA的方法。Chen等［5］用此种灵敏的实时荧光定量PCR法定量检测10例CHB患者血清和肝组织中cccDNA，发现只有6例阳性，且血清cccDNA水平和患者血清中谷丙转氨酶（ALT）和病毒载量相关。证实了该检测方法的灵敏性高、特异性强，并认为患者外周血清中出现cccDNA可能为肝脏出现损害（如炎症、坏死等）的早期表现。缪晓辉、等［3,6］对患者血清中cccDNA与乙肝患者病情轻重、病程进展的关系进行了相关研究。
从理论上推测，既然存在于肝细胞胞质和线粒体中的转氨酶等酶类在肝细胞被破坏时能释放到血液中，那么存在于肝细胞核内的cccDNA分子在肝细胞变性、坏死时应该也可以释放到血液中，而且病情越严重，变性坏死的细胞越多，对于同一个患者而言，在某一时间段内，其中的cccDNA水平应该也相应的越高，对判断病情有意义。目前通过肝活检来监测乙肝患者肝组织中的cccDNA水平变化存在着一定困难，因而监测血液中的cccDNA动态变化也许更具有现实意义。
本文对60例HBV DNA均阳性CHB患者进行分组，使用实时荧光定量PCR法检测患者血清中cccDNA。结果发现CHB轻中度组、重度及重型组、乙肝病毒携带组三组之间cccDNA水平分布位置差异有显著性；但CHB轻中度组与重度及重型组之间cccDNA水平分布位置差异无显著性；且60例患者血清cccDNA水平与代表肝功能损害的ALT、AST存在正相关关系。因此，可以初步认为CHB患者血清中出现cccDNA是肝脏损害的标志，可以反应病情的轻重及病情的进展，同时也反应了实时荧光定量PCR法检测CHB患者血清HBV cccDNA灵敏性较高、特异性强，可以应用于临床来监测乙肝患者血清中cccDNA的水平及动态变化。但也存在不少问题：本次样本量较小及所有的患者的HBV DNA均为阳性；CHB轻中度组与重度及重型组之间cccDNA水平差异无显著性，以致cccDNA水平不能确切反应患者病情轻重；另外，CHB患者的ALT、AST易受降转氨酶药物治疗等原因的影响。有待进一步增加样本数量及动态观察慢性乙型肝炎患者发病各期的cccDNA水平，以致确定HBV cccDNA水平与乙肝患者病情轻重、病情进展的关系［7］。
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7 张涛，高英堂，韩涛.乙肝病毒cccDNA的研究进展.国外医学·病毒学分册,2005，12（6）：161-165.
（编辑：石 岚)
作者单位：330006 江西南昌,南昌大学第二附属医院传染科