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【摘要】 胚胎干细胞是来源于附植前胚胎的内细胞团或附植后胎儿的原始生殖细胞具有发育全能性的细胞。近年来在胚胎干细胞分化机制研究和定向诱导分化方面都有长足进展，但其分化机制和定向分化的方法一直是人们需要解决的难点问题，本文主要就胚胎干细胞的定向分化机制、方法及目前存在的问题等方面进行概括性论述。
【关键词】 胚胎干细胞 诱导分化 机制 方法
The study on mechanism and methods on induced differentiation of embryonic stem cells
LI Lin-feng,BAI Xiu-juan,GUAN Wei-jun.Institute of Animal Sciences,Chinese Academy of Agricaltural Sciences,Beijing 100094,China
【Abstract】 Embryonic stem cell is a kind of undifferentiated pluripotent stem cell, which stems from preimplantation ICM or early fetus primordial germ cell. The research about differentiation of embryonic stem cell has been a hotspot in medical field now, but the mechanism of differentiation and the directional differentiation have not known very well. Recently, there are dramatic developments in these fields, this paper elaborated the mechanisms differentiation on induced differentiation of embryonic stem cells, methods on induced differentiation of embryonic stem cells, questions on induced differentiation of embryonic stem cells.
【Key words】 embryonic stem cell; induced differentiation; mechanism; method
自1981年英国的Evans等从小鼠囊胚的内细胞团（Inner cell mass，ICM）分离建立胚胎干细胞（Embryonic stem cells，ES细胞）以来，ES细胞的研究就一直是各国研究的热点。近两年，ES细胞分化诱导以及调控方面的研究取得了很多重要的进展，已从ES细胞诱导出神经细胞、心肌细胞、血管和内皮细胞等。利用ES细胞的定向分化可望在基因研究、细胞治疗和组织器官替代治疗等的研究中发挥重要作用。
1 ES细胞定向分化的调节机制
自1988年发现了白血病抑制因子能抑制ES细胞分化后，人们就开始研究其定向分化，通过将外源基因转入ES细胞研究其表达及微环境对细胞分化的影响，认为ES细胞的分化受内源性因素和外源性因素的共同调节。分化机制如下。
1.1 内源性影响因素 内源性因素即不同基因在不同时间和空间的开启和关闭及各种转录因子等。从分子水平来看，ES细胞分化的本质问题是基因表达调控。
1.1.1 基因的差异表达 在个体发育中，基因按照一定程序，有选择地相继活化的现象称为基因的差异表达。在胚胎发育过程中所以能相继分化出各种新类型细胞，就是由于相关基因相继活化而合成特异蛋白质的结果。Cross等［1］研究证明细胞定型时是通过强化某些基因的表达并抑制另一些基因的表达来形成某个单一谱系所特有的基因表达型。如缺乏干细胞白血病转录因子的ES细胞不能分化为血细胞和内皮细胞共同的前体细胞。
1.1.2 基因的不同表达水平 有些基因如Oct-4基因和Nanog基因等在体内通过不同的表达水平来调控ES细胞的分化。
1.1.2.1 通过Oct-4基因的不同表达水平调控ES细胞分化 Oct-4基因是ES细胞的一个特异标志分子。Oct-4是一种调节性基因，它的职责是控制其他基因的表达。无论是在体内还是体外，Oct-4基因只在全能或多能性细胞如ES细胞和EG细胞中表达。Oct-4基因的敲除使小鼠胚胎不能形成ICM，而完全由滋养外胚层组成，并在植入时死亡。RNA干扰实验显示Oct-4表达下调引起ES细胞分化，形成滋养层或内胚层，说明Oct-4基因在维持胚胎细胞的发育全能性和ES细胞不分化状态的调节中起着重要的作用。Niwa等［2］研究发现，Oct-4不同的表达水平指导ES细胞的3种不同命运，即Oct-4表达上调2倍使ES细胞分化为原始内胚层细胞，Oct-4表达下调使ES细胞分化为滋养层细胞，Oct-4表达水平不变才能使ES细胞维持不分化状态。因此，Oct-4被视为多能细胞发动、维持及分化的主要候选调控因子。
1.1.2.2 Nanog基因维持ES细胞的不分化状态 近年来在确定维持ES细胞不分化状态相关基因方面最大进展也许是Nanog基因的发现［3］。Nanog基因仅在ES细胞中特异表达，在分化的ES细胞和体细胞中不表达；Nanog基因缺陷的ES细胞失去多能性，开始分化；导入了Nanog基因的ES细胞株在LIF拮抗剂存在时仍能保持30%的不分化ES细胞。Nanog在桑葚胚等全能胚胎中不表达，仅在囊胚期的ICM中表达，之后限制在晚期囊胚的外胚层表达，胚胎植入后Nanog的表达迅速降低。体内实验还表明Nanog基因缺陷的胚胎仅包括一些不能辨认的胚外组织，而没有外胚层或胚外外胚层。这些结果提示Nanog是Oct-4基因启动后维持内细胞团全能性所必需的。Nanog的作用机制目前尚不清楚。Nanog基因只在ES细胞中发挥作用，在其他干细胞中则处于休眠状态，如果能够找出某种方法激活该基因，成体干细胞也许就能再次成为ES细胞。
1.1.3 奢侈基因 某些基因对细胞自身生存并无直接影响，不是必需的，但却决定着细胞向特殊类型分化的物质基础。如编码肌细胞肌球蛋白的基因，编码结缔组织的胶原蛋白的基因等。Michael等［4］利用心肌细胞-肌球蛋白重链的启动子转染ES细胞，结果获得了99%的心肌细胞。
1.1.4 拯救因子和免疫“豁免”特权 研究人员发现ES细胞能够分泌出特殊的“拯救因子”来逆转小鼠的致死性的先天缺陷。尽管很少有干细胞真正长成健康的心脏组织，但研究人员发现干细胞能够分泌出特殊的分子，这些分子能发出信号给临近的心脏细胞从而修复先天缺陷器官的功能。另一个研究成果表明人类ES细胞具有独特的免疫“豁免”特权。实验证实在小鼠活体内移植的未分化人类ES细胞不会引起移植排斥的特定免疫反应，这项研究对人类ES细胞移植治疗具有重要意义。
1.1.5 细胞质在细胞分化中的作用 细胞质对ES细胞的分化方向起决定性作用。调节基因差异表达的物质存在于细胞质中。每个子细胞所继承细胞质的差异决定了各子细胞沿特定的方向分化。
1.2 外源性因素 外源性因素指细胞间的分化诱导、分化抑制作用及细胞外物质的介导作用等。细胞内基因表达的调控作用是ES细胞发生分化的决定因素。但细胞所在的环境条件对ES细胞的分化也有重要影响。
1.2.1 细胞间的分化诱导 细胞间的分化诱导是指一部分细胞对邻近细胞产生影响，并决定邻近细胞分化方向及形态发生的过程。诱导分化的机制还不清楚，可能与信号传导有关。如：hES细胞与鼠骨髓基质细胞系S17细胞或卵黄囊内皮细胞系C166细胞共培养，在添加胎牛血清的条件下，hES细胞可分化为CD34+的造血祖细胞。
1.2.2 细胞间的分化抑制 细胞间的分化抑制是指在胚胎发育中，已分化的组织细胞产生抑素，抑制邻近细胞进行同样分化以避免相同的器官重复发生或过度发育。如：把发育中的蛙胚置于含成体蛙脑碎片的培养液中一起培养，胚胎则不能发育成正常脑。
1.2.3 细胞外物质的介导作用 细胞外物质的介导作用分近距离与远距离两种，起近距离介导作用的主要是细胞外基质与黏附分子，起远距离介导作用的主要是激素与细胞因子等。目前研究最多的是生长因子，生长因子可诱导hES细胞在体外分化，但没有一种生长因子能诱导hES细胞定向分化为一种特定细胞。生长因子仅仅是增加某一种类型细胞的相对数量。Schuldiner等［5］研究了8种生长因子对hES细胞的诱导分化作用，发现：苯丙酸诺龙和转化生长因子β1主要诱导中胚层细胞形成；维甲酸、血管内皮生长因子、骨形态生成蛋白4和碱性成纤维生长因子主要诱导外胚层和中胚层细胞的形成；神经生长因子主要诱导三胚层所有细胞的形成。
2 ES细胞诱导分化的一般方法
ES细胞的诱导分化是目前研究的热点，人们通过不同的途径来实现这个目的。目前主要包括：外源性生长因子诱导ES细胞分化、转基因诱导ES细胞分化、通过将ES细胞与其他细胞共培养的方式诱导ES细胞分化等。
2.1 外源细胞生长因子诱导ES细胞分化 在体外诱导ES细胞分化方面，对细胞因子诱导法研究的最为广泛和深入，获得的研究成果到目前为止也最多。体外培养下，ES细胞对细胞因子具有依赖性。培养过程中添加或撤除某一种或某些细胞因子可指导ES细胞的增殖或分化。目前在发育学方面研究比较深入的诱导因子主要有：维甲酸（retinoic acid，RA）、骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factors，FGFs）等。利用细胞因子诱导ES细胞朝一定方向分化时，一般采用分阶段的办法，即先得到类胚体（embryoid bodies，EBs），再在EBs的基础上进一步诱导使其分化为目的细胞。在各阶段添加的细胞因子不同，具体表现为细胞因子种类、浓度或组合的不同。目前利用此法，国内外学者已得到多种目的细胞，如：造血细胞、心肌细胞、神经细胞等。
2.1.1 RA诱导ES细胞分化 RA系维生素A的衍生物，它可以影响脊椎动物的发育和许多类型细胞的分化。RA不但可以通过经典的信号转导途径诱导ES细胞分化，还可以抑制LIF信号促进ES细胞分化。RA常被用来进行诱导多潜能干细胞向神经细胞分化的研究。Strbing等［6］研究显示，BLC6和D3 ES细胞自发分化产生的神经细胞只占EB的15％～30％，而用RA处理后EB中几乎全部细胞分化成神经细胞。Schuldiner等［7］证实，用高浓度RA（10-6M）诱导人ES细胞产生的神经细胞比未用RA处理的增加22％（76％:54%）。目前RA诱导ES细胞分化产生神经细胞的机制仍未阐明。已有报道指出，FGF信号通路在多种生物的胚胎神经发育过程中起关键作用［8］。Wilson等［9］也证实，FGF信号可以通过抑制BMPs表达，从而促进胚胎发育产生神经细胞。此外，Ying等［10］发现，FGF信号是ES细胞发生神经特异性分化所必需的。这些研究提示我们，RA诱导ES细胞向神经细胞分化的机制可能与FGF信号有关。
2.1.2 BMPs诱导ES细胞分化 BMPs是转化生长因子β（transforming growth factor β，TGF-β）超家族成员中最大的一族，通过调节多种基因活性，对中胚层形成、左右对称、神经系统发生、体节和骨骼发育、肢体形成及肾、胃肠、肺、牙齿的发育等基本过程产生影响。BMPs家族中，BMP-2和BMP-4在诱导ES细胞分化中发挥着重要作用。Kramer等［11］研究发现BMP-2以时间依赖的方式增加EB向软骨细胞分化，即在EB悬浮培养2～5日时加入BMP-2可以诱导其分化，而在EB悬浮培养0～2日或5～9日时加入BMP-2不产生作用。Li等［12］用猴ES细胞进行体外实验发现，将BMP-4加入ES细胞培养体系中，分化产生的造血前体细胞集落增加了17倍。Chadwick等［13］证明了BMP-4与造血细胞因子结合可以促进人ES细胞向造血系统分化。此外，Xu等［14］的实验显示BMP-4还可以诱导人ES细胞分化成为滋养层细胞。
2.1.3 FGFs诱导ES细胞分化 FGF-2是纤维母细胞生长因子家族成员，通过细胞表面的FGF受体（FGF receptor，FGFR）调节机体的生长和发育。FGFR属于酪氨酸激酶受体家族的一类，至少有5个成员，其中FGFR-1和FGFR-2是FGF-2的高亲和力的受体。FGF-2诱导的信号转导是正常细胞生长分化所必需的，参与血管新生、胚胎发育、骨骼形成等生理过程。Delra P等［15］比较了表达FGFR-1阳性和FGFR-1阴性的ES细胞分化产生心肌细胞的能力，结果显示来自FGFR-1阳性ES细胞的EB，有90%细胞分化为心肌细胞；而来自FGFR-1阴性ES细胞的EB，仅10％左右细胞分化为心肌细胞。由此可见，FGFR-1对于体外诱导ES细胞分化为心肌细胞是必需的，FGF/FGFR信号途径在体外心脏发育中发挥重要作用。此外，有研究表明FGF-2在某些情况下也可以诱导ES细胞向神经系统分化。FGF-3在原肠胚阶段的胚胎中表达，FGF-3信号途径可以促进神经系统的发育，因此利用FGF-3也可以诱导ES细胞向神经细胞特异分化。
2.1.4 其他细胞/生长因子或化合物 除以上几种主要的诱导因子之外，其他一些细胞/生长因子或化合物也能诱导ES细胞分化，如造血生长因子（hemopoietic growth factor，HGF）可以增加ES细胞向中胚层分化，最终产生心肌细胞、造血细胞等。用activin-A处理分化5日的EB在最终的分化产物中出现大量肌细胞［16］。Sachinidis等［17］研究显示TGF-β可以调节ES细胞向心肌分化。二甲基亚砜作为细胞保护剂，也可以促进ES细胞向胚胎心脏细胞分化，诱导表达GATA-4和Nkx-2.5［18］。另外有报道指出，多种细胞因子共同作用促进ES细胞特异性分化的效率更高。Li等［19］用含有EGF、IGF-1和bFGF的培养基培养EB 10日，观察到96%的细胞表达神经前体细胞特异性标志，但需要说明的是，在应用这种策略时必须明确几种细胞因子的诱导分化方向是一致的。
2.2 转基因方法诱导ES细胞分化 细胞因子诱导分化的方法虽然操作简便，但其诱导产生的成熟细胞数量较少，而且纯度较低，不利于细胞移植治疗。人们开始尝试利用转基因方法达到诱导ES细胞定向分化，它主要是利用基因转染技术使某个促分化基因在ES细胞中过表达，从而调节ES细胞的分化。转基因方法诱导ES细胞分化已经取得了较好的效果。主要体现在以下两方面。
2.2.1 促分化基因导入诱导ES细胞分化 Vicario和Schimmang［20］报道，与添加FGF-2因子相比较，利用单纯疱疹病毒作为载体将FGF-2基因转入ES细胞中，诱导产生的神经细胞是前者的三倍。Prelle等［21］研究胰岛素生长因子Ⅱ（insulin growth factor，IGF Ⅱ）促进鼠ES细胞肌分化时发现，与未过表达IGF Ⅱ基因的ES细胞对比，过表达IGF Ⅱ是可以加速并增强ES细胞分化的。以上研究表明IGF Ⅱ加速ES细胞向肌细胞分化是与改变了肌发生相关基因的表达水平有关。
2.2.2 特异性转录因子异位表达诱导ES细胞分化 特异性转录因子异位表达就是将细胞系特异表达基因导入ES细胞，并使其表达，产生特异性转录因子。细胞系特定转录因子的异位表达可诱导ES细胞分化为目的细胞系。例如，成肌细胞决定基因（MyoD）同源异型基因B4和11（HoxB 4和Hox 11）的组成型异位表达可诱导小鼠ES细胞分化为肌肉细胞［22］、造血细胞［23］。然而ES细胞内诱导分化基因的组成型表达可能对ES细胞的增殖产生危害或诱导不可预料的分化。因此利用此法诱导ES细胞分化为目的细胞系，必须建立一适宜细胞系特异性转录因子的异位表达载体系统。Vallier等［24］构建了一双顺反子基因诱捕载体，该载体可驱动外源基因在体内及离体的条件下表达，且对导入ES细胞无损伤作用。利用此法可获得高纯度的目的细胞，同样亦存在目的细胞的安全性问题。
2.3 细胞共培养的方法诱导ES细胞分化 ES细胞生长的微环境对ES细胞分化有很大的影响。为了使ES细胞维持不分化状态，人们选择在鼠胚胎成纤维细胞制作的饲养层上培养ES细胞;并在培养基中添加LIF。Kaufman等［25］证明人ES细胞与鼠骨髓细胞系S17或卵黄囊内皮细胞系C166共培养，可以促进人ES细胞向造血前体细胞分化。Mummery等［26］将人的ES细胞与鼠血管内胚层样细胞（END-2）共培养，在12孔板上大约有（35±10）%的孔出现了搏动的区域，而且诱导的心肌细胞具有正常心肌细胞的功能。
以上三种诱导方法并不是孤立的，它们可以有机地结合起来。Kyba等［27］证明在ES细胞中条件表达Stat5可以诱导造血分化，而将表达Stat5的EB置于OP9基质细胞上培养，进一步增强了造血发生。这种相互结合的诱导方法有着广阔的应用前景。
3 ES细胞体外定向诱导分化研究存在的问题
ES细胞的定向诱导分化是ES细胞研究的主要方向，它为今后临床上进行细胞移植治疗提供了充足且良好的细胞来源，并且通过对诱导分化的研究可以揭开人类自身发育的神秘面纱;但是迄今为止，仍然未找到可以诱导生成大量较为单一细胞的方法。细胞因子诱导方法虽然被广泛采用，但由于ES细胞自身也可以分泌一些生长因子，影响诱导效果，而且细胞因子方法诱导产生的特定细胞数量较少，纯度亦不高，诱导特异性分化后还需要进行细胞筛选。转基因诱导方法研究应用时间较短，在ES细胞中过表达某一诱导分化的基因可以大大提高诱导分化的效率，得到纯度较高的分化细胞，然而目的基因的稳定转染却是摆在研究人员面前的一大障碍，而且转染基因容易发生突变从而影响了整个ES细胞基因组的稳定性。此外，诱导效率不高，寻找适合的共同培养条件较为困难，使得细胞共培养方法目前尚未得到广泛应用。还有特定分化细胞的扩增、ES细胞向有功能器官的分化、分化细胞应用于移植治疗的免疫排斥和安全性等问题仍未解决。但我们相信，随着新的发育相关基因的不断被发现，诱导ES细胞分化方法的不断成熟，稳定高效转染ES细胞方法的建立，ES细胞在组织工程等领域必将会有更广阔的应用前景。
总的来说，ES细胞的定向诱导分化研究是一项探索性很强，具有重大意义的研究课题。我们相信，随着这些关键性问题的解决，ES细胞定向分化的机理一定能够阐明。
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作者单位：100094 北京，中国农业科学院北京畜牧兽医研究所