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【关键词】 艾滋病
本文对1例艾滋病患者(与河南籍男友通过性途径感染)HIV-1病毒进行了分离。通过收集疾病预防控制中心实验后样品——患者的静脉血，分离其外周血单核淋巴细胞，与健康人来源的外周血单核淋巴细胞共培养以增殖HIV-1病毒。通过逆转录酶活性确定培养体系中是否有HIV-1病毒的扩增。
1 材料与方法
1.1 材料来源 新鲜采集的健康人来源静脉血(源于山西省太原市中心血站)，HIV-1患者静脉血(通过山西省太原市疾病预防控制中心采集)。
1.2 外周血单核细胞(PBMCs)的分离与培养 将新鲜采集的抗凝静脉血分置于高压灭菌的50ml离心管中，室温下3000 rpm离心30min；吸取中间层云雾层单核细胞，加入含4倍体积PBS的50ml离心管中, 3000 rpm离心30min；在淋巴细胞分离液上层缓慢加入离心后中间层云雾狭窄带淋巴细胞，淋巴细胞分离液与加入的淋巴细胞体积比大约为1:3为宜，3000 rpm离心30min；中间层呈白色云雾层狭窄带为淋巴细胞。吸取云雾层单核细胞，分别加入4倍体积PBS和无血清的RPMI1640培养液洗涤，加入PBMC生长培养基(RPMI1640，含10% FBS，PHA 5μg/ml)培养；计数，100μL细胞悬液+ 400μl培养基+500μl 0.4%台盼蓝染液混合，室温放置5min，取适量滴于血球计数板计数；按2×106/ml密度接种于75cm2细胞培养瓶，37 ℃，5%CO2细胞培养箱培养2～3天，刺激PBMCs的增殖。
1.3 HIV-1阳性患者PBMCs与健康人PBMCs共培养 取HIV-1阳性患者PBMCs和经过刺激增殖的健康人PBMCs，按1:1的配比以2×106/ml密度加入25cm2细胞培养瓶，再加入20U/ml的IL-2，置37 ℃，CO2细胞培养箱培养；每隔3天弃去一半的培养基，再加入含有20U/ml IL-2的新鲜培养基，将取出的培养基用1.5ml的Ependof 管冻存于-80℃；在培养的第8、17天加入等量新鲜的PHA刺激过的健康人PBMCs，继续置细胞培养箱培养；将历次取出的培养液取出，用Reverse Transcriptase Assay, colorimetric* (Roche)试剂测定样品中的逆转录酶活性，确定培养体系中病毒的增殖高峰。
1.4 逆转录酶活性测定 (1)取样品于4℃、8000×g 离心10min 去除细胞碎片，取上清与PEG2:1体积比小心混匀，冰上置放过夜；(2)4℃，8000×g离心10min，弃上清并尽量移去PEG；(3)用50～60μl裂解液(solution 4)重悬沉淀，15℃～25℃放置30min，以完全裂解病毒；(4)取40μl病毒裂解液，加入20μl反应液(solution 3a)，37℃孵育1～15h；(5)将60μl逆转录液移入微孔板中，标记好名称，加盖于37℃孵育1h；(6)仔细移去微孔板内上清，用250μl洗液(solution 6)清洗5 次，每次30s，最后尽量去净上清；(7)每孔加入200μl anti-DIG-POD 工作液(solution 5a)，S5:S8=1:100 稀释，加盖37℃孵1h，清洗5次，同步骤6；(8)每孔加入ABTS 基质液(solution 7)或含基质增强剂的ABTS 基质液(solution 7a)200μl 15℃～25℃孵育至显色；(9)酶标仪读数。
2 结果
通过上述人淋巴细胞分离方法分别分离健康人和患者的PBMCs，分别计数分离的患者PBMCs为5×106；计数刺激生长的健康人PBMCs细胞密度并取5×106细胞与患者PBMCs混合，加入IL-2至终浓度为20U/ml放置37℃ 5%CO2细胞培养箱共培养。
测定逆转录酶活性(见图1)显示，培养体系中从第6天收集的培养上清开始有明显的逆转录酶活性，表明有HIV-1病毒的增殖；在培养到第11天时，培养体系中的逆转录酶活性达到顶峰，说明HIV-1病毒增殖至高峰，在随后的培养上清中，逆转录酶活性急剧下降。保存第8天和第11天收集的培养上清作为分离的病毒样本。图1 逆转录酶活性测定
3 讨论
共培养的成功与否对于分离的PBMCs质量有很大的关系，本研究将分离的PBMCs培养1天后轻轻晃动细胞培养瓶，吸取上清接种入另一新的细胞培养瓶继续培养。同样，为了获得更高质量的PBMCs，在分离PBMCs过程中尽量去除血清层有助于获得质量更好的PBMCs。
共培养的成功还有另一个重要的因素就是要求分离的血液样本新鲜，该研究的实验样本在患者血液采集的当天完成PBMCs分离，保证了实验的顺利进行。
作者单位：110161 辽宁沈阳，沈阳农业大学畜牧兽医学院