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【摘要】 目的 建立鼠疫菌外膜蛋白提取的方法，研究中国鼠疫菌外膜蛋白的种类，比较各生态型之间的差别用于鼠疫菌分型，将其研究成果应用于青藏铁路鼠疫防治。方法 鼠疫菌经破碎后采取超高速离心法提取外膜蛋白，利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)电泳系统分离鼠疫菌外膜蛋白，用分析软件分析菌外膜蛋白的种类和分子量。结果 在10%的SDS-PAGE上我国各生态型鼠疫菌在37℃条件下表达的外膜蛋白带最多的为26条， 28℃可表达的外膜蛋白带最多的为36条，各生态型之间除具有共同的外膜蛋白带外亦存在差别，由此将中国鼠疫菌划分为6种外膜蛋白类型，青藏铁路沿线鼠疫菌为外膜蛋白YOP1型。结论 中国各生态型鼠疫菌外膜蛋白种类存在一定的差异，青海田鼠型菌株和布氏田鼠型菌株所产生的外膜蛋白具有更多的相同之处，外膜蛋白可作为鼠疫菌基因分型的一个指标，可在全国其他类型的鼠疫疫源地应用。
【关键词】 鼠疫菌;外膜蛋白种类;外膜蛋白差异;基因分型;青藏铁路;鼠疫防治
【Abstract】 Objective To establish the abstracting method of Y.pestis out membrane protein , to study the kind of the Y.pestis out membrane protein , the differences of all kinds of the Y.pestis ecotype are used to type and apply the result of plague control and prevention of Qinghai-Tibet Railway.Methods The Y.pestis was smashed and the Y.pestis out membrane protein was abstracted by hyperelocity centrifuge and SDS-PAGE electrophoresis system，to analysis the kind and molecular weight of the Y.pestis out membrane protein,use the analysis software. Results All Chinese ecotype of Y.pestis could create the most 26 Y.pestis out membrane protein bands in 10% SDS-PAGE at 37℃,and the most 36 Y.pestis out membrane protein bands were created at 28℃.All Chinese Y.pestis could be divided into six out membrane protein types.The type of Y.pestis out membrane protein along the Qinghai-Tibet railway is Yop1.Conclusions There are some differences of the out membrane protein of all Chinese Y.pestis ecotype,the out membrane protein of Microtus fuscus strain and Microtus brandti strain have some same places.Out membrane protein could be used in type in the Y.pestis，this method can be extended to other types of plague natural foci.
【Key words】 Y.pestis;the kind of out membrane protein;the differences of out membrance protein;gene type;Qinghai-Tibet Railway;plague control and prevention
耶尔森菌属中致病性细菌有3种，其中鼠疫耶尔森菌是引起鼠疫的病原体。随着分子生物学的发展，人们对鼠疫菌有了进一步的了解。近些年研究报道的鼠疫菌质粒、染色体以及由此衍化出来的基因诊断技术，被广泛应用于实验室研究和现场调查[1～3]。随着电泳技术的发展，人们能够分离和识别更多的蛋白质成分。通过细菌的蛋白质电泳图形，可以研究细菌合成蛋白质的种类以及数量，并可成为细菌种属或者某一类型菌株的特征。鼠疫菌外膜蛋白(Yops)是近些年对鼠疫菌进行基础研究内容之一[4]。本试验全面的研究了我国12种类型鼠疫疫源地中18个生态型鼠疫菌的Yops，观察了我国鼠疫菌产生Yops的种类，并进一步分析各生态型鼠疫菌间Yops的差异，为鼠疫菌的基因分型奠定了基础。并且将该研究成果应用于青藏铁路沿线鼠疫菌的监测及青藏铁路鼠疫防治工作中，深入细致地了解该地区鼠疫菌生物学特征，为青藏铁路沿线鼠疫防治和基础研究提供了科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料及来源
1.1.1 菌株
全国12种类疫源地18个生态型，每型3株菌以上，共用试验菌株70余株，青藏铁路沿线分离出的鼠疫菌12株，由中国疾病预防控制中心鼠疫布氏菌病预防控制基地保藏。
1.1.2 试剂
聚丙烯酰胺，华美生物工程公司，SERVA进口分装880409;甲叉丙烯酰胺，Fluka CH 9470;β-巯基乙醇，SIGMA 111F-0272;Triton X-100，香港9002-93-1;Hepes，北京东方科技公司 B.M.Germany进口分装1508;考马斯亮蓝R-250，AMResco 1350B14;低分子量标准蛋白质，上海丽珠东风生物技术有限公司，兔磷酸化酶(97 400)、牛血清白蛋白(66 200)、兔肌动蛋白(43 000)、牛碳酸酐酶(31 000)、胰蛋白抑制剂(20 100)。
1.1.3 仪器
超声波细胞破碎器，UP200S 德国制造;超高速离心机，SCP85H 日本日立公司;高速离心机，KUBOTA KR/200FA 日本久保田公司;电泳仪，DYY-Ⅲ2型稳压稳流电泳仪，北京六一仪器厂;凝胶成像分析仪， amersham pharmacia biotech。
1.2 方法
1.2.1 细菌培养
将被试菌株接种在营养琼脂斜面各2支，分别置28℃和37℃培养24～48h，斜面培养物放入氯仿棉球，熏蒸1h后洗菌。
1.2.2 洗菌
将斜面培养物用0.01mol/L PBS洗下后，5500r/min，离心20min，离心洗涤2次，沉淀物加入I液5ml，4℃或室温过夜。
1.2.3 外膜蛋白的制备
超声波破碎菌体后的菌液经7500r/min，离心20min，取上清液40000r/min，离心1h，弃上清液取沉淀物加入II液2ml，4℃过夜;40000r/min，离心1h，取沉淀物加入200μl样品缓冲液，置-20℃ 备用。
1.2.4 电泳及条件
用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)电泳系统分离外膜蛋白，以4%浓缩胶，10%分离胶。加样40μl，电压80V，电泳时间16h。
1.2.5 染色及脱色
电泳结束后经染色液染色6h左右，再用脱色液于摇床上脱色至蛋白带清晰为止。
1.2.6 外膜蛋白带及分子量的确定
在凝胶成像分析仪上自动读取外膜蛋白带，以低分子量标准蛋白质为参数，经微机中分析软件计算出各测定菌株的外膜蛋白带和每条蛋白带的分子量。
2 结果
2.1 外膜蛋白提取方法的建立
经过几年的试验研究建立了稳定的提取鼠疫菌外膜蛋白的方法，经电泳分析后外膜蛋白带清晰可见，该方法适合我国各类鼠疫疫源地鼠疫菌的应用[5]。
2.2 鼠疫菌外膜蛋白的种类
在10%的SDS-PAEG上，我国各生态型鼠疫菌37℃条件下的培养物所表达的Yops为26条蛋白带，见图1。从左到右菌号为：12026、01073、34002、38003、51002、97001、84014、47003、124001、74002、99082、43002、42002、49001、90001、46001、80069、EV、M图1 37℃条件各生态型鼠疫菌YOPS的类型在同样电泳条件下我国各生态型鼠疫菌28℃培养物表达的Yops最多的则有36条蛋白带[6]，见图2。从左到右菌号为：12026、01073、34002、38003、51002、97001、84014、47003、124001、74002、99082、43002、42002、49001、90001、46001、80069、M图2 28℃条件各生态型鼠疫菌YOPS的类型
2.3 各生态型鼠疫菌外膜蛋白的差异
锡林郭勒高原布氏田鼠型菌株和青藏高原青海田鼠型菌株Yops的类型一致，并且与旱獭等其他生态型菌株不同。最明显的差异是缺少119、34、32KD的Yops带，见图3。从左到右菌号为：川0001、川0003、川0005、川0007、川0009、No10003、91001、91003、91004、91005、91018、91023、51002、12029、30008、34008、EV、M图3 37℃条件青海田鼠鼠疫菌YOPS的类型通过试验证明，分离自四川省石渠县青海田鼠的鼠疫菌，在28℃培养条件下，与对照的喜马拉雅旱獭菌株比缺少28、31和32KD的YOPs带，见图4。从左自右：950724、950724-1、950724-2、EV、950724-4、川0001、川0003、川0005、川0007、川0009、川0011、No10003、No10004、No10013、No10020、91001、M图4 28℃条件YOPS类型另外，其他生态型菌株之间的外膜蛋白也存在一定的差异。37℃条件下滇西纵谷型、黄土高原B型、鄂尔多斯高原型、北天山东段型、北天山西段A型、北天山西段B型和滇闽居民区生态型菌株与其他生态型菌株相比缺少90 KD蛋白带;祁连山型、鄂尔多斯高原型、北天山西段A型和北天山西段B型的鼠疫菌菌株缺少39 KD蛋白带。28℃条件下青藏高原型、冈底斯山型和北天山东段生态型菌株与其他生态型菌株相比缺少68 KD蛋白带;北天山西段A型和北天山西段B型鼠疫菌株缺少39 KD蛋白带;冈底斯山型、滇西纵谷型、黄土高原A型、黄土高原B型、鄂尔多斯高原型、北天山西段A型和北天山西段B型的鼠疫菌株缺少38 KD蛋白带。另外，其他生态型菌株的23 KD蛋白带非常浓，而锡林郭勒高原布氏田鼠型菌株此蛋白带较淡，且多出一条22 KD的蛋白带，图2第15泳道。
2.4 鼠疫菌外膜蛋白的分型
经试验研究，我们根据37℃条件下鼠疫菌外膜蛋白产生的数量、不同分子量外膜蛋白的缺失或增加，将鼠疫菌分为6个外膜蛋白型别，即YOP1、YOP2、YOP3、YOP4、 YOP5和YOP6。
2.4.1 YOP1型
该型是具有较全外膜蛋白的鼠疫菌株，分布于青藏高原型、冈底斯山型、帕米尔高原型、松辽平原A型、松辽平原B型、昆仑山A型、昆仑山B型、黄土高原A型8个生态型的鼠疫菌株。
2.4.2 YOP2型
该型是缺失90KD外膜蛋白的鼠疫菌株，分布于滇西纵谷型、黄土高原B型、北天山东段型、滇闽居民区型4个生态型的鼠疫菌株。
2.4.3 YOP3型
该型是只缺失39KD外膜蛋白的鼠疫菌株，分布于祁连山型1个生态型的鼠疫菌株。
2.4.4 YOP4型
该型是同时缺失90KD和39KD 2种外膜蛋白的鼠疫菌株，分布于鄂尔多斯高原型、北天山西段A型、北天山西段B型3个生态型的鼠疫菌株。
2.4.5 YOP5型
该型是缺少119、87、82、64、34、32、30和24KD 8条外膜蛋白的鼠疫菌株，主要分布于锡林郭勒高原型和青藏高原青海田鼠型2个生态型的鼠疫菌株。
2.4.6 YOP6型
根据28℃条件下外膜蛋白的图形，锡林郭勒高原布氏田鼠型菌株与其他生态型比较多出一条22 KD的蛋白带，据此将锡林郭勒高原型单独分为一个YOP型，由此也可将锡林郭勒高原型与青藏高原青海田鼠型区分开来。
2.5 在青藏铁路鼠疫防治重点应用
本试验在完成鼠疫菌外膜蛋白种类及基因分型的基础上，选用青藏铁路沿线不同宿主、媒介的12株强毒鼠疫菌，进行鼠疫菌外膜蛋白基因分型应用的研究。结果证实试验用的青藏铁路沿线鼠疫菌37℃条件下的培养物所表达的外膜蛋白为26条蛋白带[7]，其分子量分别是：119、116、111、103、97、94、90、87、84、79、73、70、65、62、58、52、47、42、39、36、34、32、30、29、26、24KD。28℃培养物表达的外膜蛋白为36条蛋白带，其分子量分别是：119、116、111、103、97、94、90、87、80、73、70、68、65、62、58、56、53、50、48、47、42、39、38、36、35、34、32、30、29、27、26、25、24、22、19、16 KD，见图5、图6。1、14EV;2、3青海天峻;4、5青海乌兰;6、7青海刚察;8、9青海海晏;10、11青海格尔木;12、13西藏那曲; 15Mark图5 试验用菌株37℃外膜蛋白检测结果1、14EV;2、3青海天峻;4、5青海乌兰;6、7青海刚察;8、9青海海晏;10、11青海格尔木;12、13西藏那曲;15Mark图6 试验用菌株28℃外膜蛋白检测结果对青藏铁路沿线12株鼠疫菌外膜蛋白进行了分析，发现不同地点的鼠疫菌具有共同的外膜蛋白带。但37℃条件下和28℃条件下所产生的外膜蛋白带不同。根据鼠疫菌外膜蛋白分型的研究，将青藏铁路沿线鼠疫菌划归为外膜蛋白YOP1型[8]。
3 讨论
鼠疫菌能分泌一组由温度调控、PCD1质粒编码的高标准表达的毒力蛋白(Yops)和V抗原(LcrV)，其合成与分泌的条件是，在体外缺钙、37℃条件下合成并分泌Yops和LcrV产物，这一分泌过程由Ⅲ型分泌系统调控[9]。本试验对我国12种类疫源地18个生态型70余株鼠疫菌和青藏铁路沿线12株鼠疫菌进行了外膜蛋白研究，发现各生态型鼠疫菌具有共同的外膜蛋白带，但又存在差别。周详等[10]对锡林郭勒高原型、鄂尔多斯高原型和青藏高原型3个生态型鼠疫菌37℃条件下外膜蛋白进行研究，报道结果锡林郭勒高原型与另2个生态型鼠疫菌比较缺少34和32 KD的蛋白带。本试验结果证实了这一结论。万马等[11]采用核糖体分型系统将我国17个生态型鼠疫菌分为4个核糖体型，即RT A、RT B、RT C和RT D。
本试验用外膜蛋白方法将我国18个生态型鼠疫菌划分为6种类型。外膜蛋白型存在一定的地域性。从宿主上看，各自然疫源地的鼠疫菌虽然有各自的主要储存宿主，但同一疫源地不同宿主分离的鼠疫菌的外膜蛋白型没有明显变化;而且同一种宿主在不同的自然疫源地有不同的外膜蛋白型。说明以往按宿主的不同进行鼠疫菌的分类存在不合理之处。青藏铁路沿线鼠疫菌为外膜蛋白YOP1型。此研究成果可在全国其他类型的鼠疫疫源地应用。
【参考文献】
1 Goncharov YA，Goncharov KE，Alutin MI，et al. Localization of A DNA fragment coding for fraction I synthesis on the pYT plasmid of the plaguemicrobe.MolekulyarnayaGenetika.Mikrobiologiya Virrusologiya，1992，11(10):18-23.
2 Rakin A， Bolgakowa E，Heesemann J. Structural and functional organization of the Yersiniapestis bacterocin pessticin gen cluster. Microbiology, 1996,142(12): 3415.
3 Tsukano H，Itoh k，Suzuki S， et al. Detection and identification of Yersinia pestis by polymerase chain reaction (PCR) using multiplex primers. Microbiol-Immunol，1996，40(10): 773.
4 Mikerov AN，Kutyrev VV. Yersinia outer membrane proteins coded for by the virulence plasmid. Mol Gen Microbiol Virusol，1997, (3): 3.
5 王忠惠，张春华，丛显斌. 鼠疫菌外膜蛋白提取方法的建立. 中国地方病防治杂志， 2001，16(5)：276.
6 张春华，丛显斌，王忠惠，等. 中国鼠疫菌外膜蛋白种类的研究. 中华流行病学杂志，2003，24(增刊)：42.
7 丛显斌，张春华，赵斌，等.青藏铁路沿线鼠疫菌外膜蛋白种类的研究.中国媒介生物学及控制杂志，2008，19(5)：451-453.
8 张春华，丛显斌，王忠惠，等.中国鼠疫菌外膜蛋白种类及在基因分型中的应用. 中国地方病防治杂志，2005，20(4)：193.
9 Day JB, Ferracci F, Plano GV.Translocation of YopE and YopH intoeukaryotic cells by Yersinia pestis yopH,tyeA,sycN,yscB and LcrG deletion mutants measured using a phosphorylatable peptide tag and phosphospecific antibodies. Mol Microbiol,2003,47(3):807.
10 周详，樊振亚. 耶尔森鼠疫菌不同生态型外膜蛋白的初步研究. 中华流行病学杂志，1993，14(特刊7号)：138.
11 万马，丛显斌，赵铭山，等.中国鼠疫耶尔森氏菌核糖体分型. 中国地方病防治杂志，1999，14(特刊)：66.