点击显示 收起
【摘要】 目的探讨核转录因子κB-p65(nuclear factor-κB-p65，NF-κB-p65)、CD15S蛋白在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达及其与浸润、转移的关系，探索非小细胞肺癌发生、发展的机制。方法收集手术切除的70例NSCLC及15例癌旁正常组织标本，RT-PCR方法检测NSCLC及癌旁组织中NF-κB-p65mRNA的表达，免疫组织化学法检测组织中CD15S蛋白表达情况。结果NF-κB-p65 mRNA在NSCLC的表达显著高于癌旁正常肺组织(P<0.05)。其中腺癌组织表达高于鳞癌组织表达，比较差异有显著性(P<0.05)。在70例肺癌组织中CD15S蛋白的表达阳性率为64.3%，15例癌旁正常肺组织CD15S蛋白的表达为阴性，CD15S蛋白表达在NSCLC和癌旁组织比较差异均有显著性(P<0.05)。NF-κB-p65mRNA、CD15S蛋白的表达与组织学类型、分化程度、TNM分期和淋巴结转移有关，单因素方差分析发现NF-κB-p65mRNA表达和CD15S蛋白表达相关。结论NSCLC中NF-κB-p65和CD15S蛋白的表达有相关关系，NF-κB-p65和CD15S可能在NSCLC浸润、转移过程起促进作用。
【关键词】 肺癌;NF-κB-p65;CD15S;转移
【Abstract】ObjectiveTo investigate expression of nuclear factor(NF)-κB-p65 and CD15S in lung cancer tissues, and to explore its relationship between the expression and tumor cell metastasis and infiltration and tumor apoptosis,and to explore the possible molecular mechanism of lung cancer cell metastasis and infiltration.Methods70 samples of lung cancer tissues and 15 normal lung tissues after surgical ablation were collected.RT-PCR method was used to detect the expression of NF-κB-p65mRNA in lung cancer tissues and lung tissues around tumor. Cell apoptosis index in tissues was detected by the TUNEL method.The expression of CD15S was detected in these tissues with Immunohistochemistry.ResultsThe expression of NF-κB-p65mRNA in lung cancer tissues was significantly higher than that in lung tissues around tumor.The expression of NF-κB-p65 mRNA in adencarcinoma tissues was higher than that in small cell lung cancer and squamous carcinoma tissues,the expression of three groups had significantly difference(P<0.05). Cell apoptotic index in lung cancer tissues was significantly lower than that in lung tissues around tumor(P<0.05), by correlation analysis the expression of NF-κB-p65mRNA was negative correlated with apoptotic index in lung cancer tissues. The positive rate of CD15S was 64.3%, but the expression of CD15S in 15 cases of lung tissues around tumor was negative. The difference of expression in the two groups was statisitically significant(P<0.05). The expression of the NF-κB-p65 mRNA and CD15S protein was associated with the tumor cell differentiation,the lymph node metastasis, TNM staging and pathological typing.ConclusionThe expression of NF-κB-p65 and CD15S in lung cancer tissues showed correlativity, NF-κB-p65 and CD15S may facilitate lung cancer cell metastasis and infiltration; NF-κB-p65 mRNA was negative correlated with apoptotic index in lung cancer tissues.NF-κB-p65 may enhance lung cancer cell differentiation and proliferation,and play a antiapoptotic role in lung cancer.
【Key words】lung cancer;NF-κB-p65;CD15S;metastasis
21世纪以来，我国肺癌的发病率和死亡率在恶性肿瘤中已经上升为第一位[1]。目前肺癌治疗的疗效欠佳，故进一步研究肺癌发生发展的机制，从而制订有效的治疗方案是相当重要的。核因子κB (NF-κB)是目前肺癌研究的热点，NF-κB可能通过抗凋亡和增强黏附分子的表达，促进肿瘤细胞的生长和在血管壁上黏附[2]。CD15S蛋白(Slex称为唾液酸化的路易斯-X，Sialyl Lewis-X)是表达在细胞表面糖脂及糖蛋白上的含有寡聚糖的一组碳水化合物抗原，与恶性肿瘤的恶化和转移有关。Dissanayake S等研究发现在幼稚的脾细胞中，NF-κB-p65增强CD15S的表达，而后者在腹腔炎性渗出细胞中促进干扰素-γ的表达[3]。而目前对NF-κB和CD15S蛋白在肺癌组织、癌旁组织中表达研究较少。本研究检测NF-κB-p65mRNA及CD15S蛋白在肺癌组织、癌旁组织的表达，探讨其与肺癌浸润、转移和肺癌组织细胞凋亡的关系。
1材料与方法
1.1研究对象取自泸州医学院附属医院从2008年12月至2010年6月的心胸外科手术切除的肺癌组织标本，入选研究的肺癌病例满足以下标准：(1)术前均未接受过化疗、免疫治疗或放疗;(2)未使用任何抗炎药物;(3)无慢性心肝肾及内分泌疾病，共70例，其中鳞癌33例，腺癌24例，小细胞癌13例，男性45例， 女性25例;年龄最大80岁，最小35岁，平均60岁。手术中取肺癌组织及相应的癌旁正常组织15例(自所切除肺叶距离病灶最远处5cm的正常组织，分别来源于鳞癌7例，腺癌5例，小细胞癌3例 )，组织离体后在1 h内放入液氮速冻，置-80℃冰箱保存。病理组织切片HE染色由2位有经验的临床病理学专家阅片作出病理诊断。
1.2试剂Rever Tre Ace-a-逆转录试剂盒购自日本TOYOBO公司，Trizol试剂购自美国 Invitrogen公司，Taq酶购自上海生工生物工程技术服务有限公司，PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，CD15S鼠抗人单克隆抗体、原位细胞凋亡检测试剂盒、PV-8000免疫组化试剂盒及D A B显色试剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司。PCR System 9700(Applied Biosystems, Int.,USA)。
1.3方法
1.3.1RT-PCRTrizol裂解100mg新鲜非小细胞肺癌组织，氯仿和异丙醇抽提细胞总RNA。MMLV转录酶将1μg RNA逆转录成cDNA。随后PCR检测NF-κB-p65 m R N A的表达。NF-KB-p65上游引物:5′CAAGCGAGGAGGGGACGTG 3′ ,下游引物：5′CCCCCAGAGCCTCCACCC 3′，以GAPDH为内参照，其上游引物：5′TGGGGTGATGCTGGTGCTGAGT3′，下游引物：5′AGGTTTCTCCAGGCGGCATGTC 3′。PCR反应条件94℃—5min→(94℃—30s→60℃—30s→72℃—30s)×30循环→72℃—10min，电泳：100ml TAE缓冲液中加入1g琼脂糖，微波炉中加热溶解，溶解后冷至60℃，加入5μl EB染料，倒入已插入梳子的制胶槽中，待其冷却凝固后待用。紫外光下观察并照相， 测定各条带A值。以同一管中NF-KB-p65和GAPDH产物条带A值之比作为数据分析， 反映NF-KB-p65 mRNA表达水平。
1.3.2免疫组织化学染色用石蜡切片脱蜡和水化后，0.01MKPBS清洗5min×3;加入配好的0.3%的过氧化氢甲醇溶液30min，0.01MPBS清洗5min×3;加入配好的0.3% TritonX100 30min，0.01MPBS清洗5min×3;加入用血清稀释液稀释的一抗CD15S，4℃存放24~48h;吸去抗体，0.01MPBS洗5min×3;PBS代替一抗作为阴性对照。加入0.01MKBS稀释的PV-8000中的二抗-HRP多聚体，室温孵育2h。蒸馏水迅速冲3次;加入显色液，进行免疫组织化学显色，20min，可不时在显微镜下进行观察，待细胞着色而背底颜色较淡时马上吸去显色液，用蒸馏水迅速冲3次后加入0.01MPBS终止反应;梯度酒精脱水之后，封片，拍照。CD15S阳性信号为细胞胞膜和/或细胞胞质内出现棕黄色或棕褐色染色颗粒。凡无阳性染色细胞或阳性染色细胞数<5%者为阴性，阳性染色细胞≥5%者为阳性。
1.4统计学方法数据使用SPSS-17.0统计软件分析，NF-κB-p65mRNA表达水平及肺癌组织的细胞凋亡指数的数值以〖x〗±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD-t检验，15例癌旁组织和相应的癌症组织的结果采用配对统计检验。对CD15S蛋白数据进行χ2检验，参数之间关系采用Pearson相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1NF-κB-p65mRNA在肺癌组织和癌旁组织中的表达NF-κB-p65 mRNA在肺癌组织中的表达(见表1，图1)：NF-κB-p65 mRNA的表达在腺癌组织较强，小细胞癌组织表达次之，鳞癌组织表达较弱，三组表达的比较差异有显著性(P<0.05)。NF-κB-p65基因mRNA的表达与组织学类型、淋巴结转移、分化程度、TNM分期有关，与年龄、性别无关。15例癌组织和相应癌旁组织的NF-κB-p65 mRNA的表达比较差异有显著性(F值4.86，P<0.05)。
2.2CD15S蛋白在肺癌组织和癌旁组织中的表达70例肺癌组织中有45例CD15S表达阳性，表达阳性率为64.3%，15例癌旁正常肺组织CD15S的表达均为阴性(见表2，图2)，肺癌组织中CD15S表达阳性率显著高于癌旁正常肺组织(P<0.05)。CD15S在腺癌的表达阳性率为90.5%(19/21)，显著高于小细胞癌25.0%(3/12)，CD15S在鳞癌的表达阳性率为51.9%(14/27)，和小细胞肺癌无显著差异。CD15S表达阳性率与肺癌组织分化程度、淋巴结转移、组织学类型、TNM分期有关，与肺癌组织年龄、性别无关。表1NF-κB-p65 mRNA的表达与肺癌临床和病理学特征的关系图1肺癌组织和癌旁组织中NF-κB-p65 mRNA的表达表2CD15S的表达与肺癌临床和病理学特征的关系
2.3肺癌组织中CD15S蛋白阳性和阴性两组NF-κB-p65mRNA表达比较见表3。肺癌组织CD15S蛋白阳性和阴性两组中NF-κB-p65mRNA表达比较差异有显著性，CD15S蛋白阳性高于阴性组，提示CD15S和NF-κB-p65相关。表3肺癌组织中CD15S蛋白表达阳性组和阴性组 NF-κB-p65mRNA表达的比较
2.4肺癌组织及癌旁组织中的细胞凋亡指数比较见表4。在肺癌组织中小细胞癌的细胞凋亡指数较小，和鳞癌、腺癌的细胞凋亡指数差异有显著性，鳞癌和腺癌的细胞凋亡指数差异无显著性。15例癌组织和相应癌旁组织的细胞凋亡指数的表达比较差异有显著性(F值4.86，P<0.05)。表4肺癌组织和癌旁组织中细胞凋亡指数情况
2.5肺癌组织中NF-κB-p65 mRNA的表达和其细胞凋亡指数Pearson相关性分析在肺癌组织中NF-κB-p65 mRNA表达量为0.43±0.10，肺癌组织的细胞凋亡指数为(5.40±0.72)%，NF-κB-p65 mRNA表达水平和肺癌组织的细胞凋亡指数呈负相关，相关系数为-0.532，P<0.001。
3讨论
NF-κB是一种具有多向调节功能的转录因子，通常以同源或异源二聚体形式出现，其中以 p50/p65分布和作用最广泛。NF-κB在多种恶性肿瘤包括乳腺癌、结肠癌、肺癌呈现高表达，提示NF-κB和肺癌的发生、发展及预后均有一定的关系[4~6]。CD15S蛋白是表达在胚胎细胞和肿瘤细胞表面糖蛋白、糖脂上含寡聚糖的一组碳水化合物抗原，是细胞黏附分子E-选择素识别的配体[7]。有研究发现在胆囊癌、口腔鳞状细胞癌、肺癌、肝癌组织中CD15S蛋白的表达是增强的，并且和癌细胞的远处转移有关[8~11]。而在肿瘤细胞内呈高表达的CD15S可诱导血管内皮细胞产生E-选择素，在钙离子的参与下两者特异性结合后形成稳固连接并黏附内皮细胞上，促进肿瘤细胞穿出血管或淋巴管内皮细胞，进入血液循环或淋巴循环，从而在靶器官浸润、转移[12]。 目前发现E-选择素基因转录的启动子可能存在NF-κB结合的位点，NF-κB和位点结合后，促进E-选择素基因转录，调控E-选择素表达水平[13]。Grünewald JK等在研究内皮细胞时，发现NF-κB可调控E-选择素和胞间黏附分子、血管细胞黏附分子-1的表达[14]。CD15S是E-选择素特异性识别的配体，故NF-κB和CD15S可能在肿瘤的发生、发展过程存在某些联系。在本研究中同时检测了NF-κB-p65mRNA、CD15S蛋白在肺癌组织和癌旁组织中的表达(见表1、表2，图1、图2)，NF-κB-p65mRNA、CD15S蛋白在肺癌组织中表达均显著高于相应癌旁组织，NF-κB-p65mRNA、CD15S蛋白的表达在低分化组、淋巴结转移组和TNM高分期组分别显著高于高分化组、无淋巴结转移组和TNM低分期组中，提示NF-κB-p65mRNA、CD15S参与了肺癌的浸润、转移过程，临床上可以把NF-κB-p65mRNA、CD15S作为肺癌的诊断指标，对病例指标的定期随访可以作为肺癌的早期诊断及早期发现肺内转移病灶。在肺癌的病理类型中，腺癌组织的NF-κB-p65mRNA、CD15S蛋白表达较强，可能和腺癌组织富含血管，局部浸润和血行转移较早有关。进一步分析发现NF-κB-p65的表达和CD15S在肺癌组织中的表达有相关关系，推测NF-κB可以通过一定途径调控CD15S的表达，NF-κB和CD15S可能共同参与了肺癌的发生、发展，其作用机制还有待进一步研究。肺癌浸润转移的过程是一个复杂的过程，其中凋亡机制失控占重要地位，一旦凋亡机制被抑制，就会出现细胞寿命的延长及细胞的过度累积。Wang S等发现NF-κB活化后可以诱导恶性肿瘤细胞产生抗凋亡蛋白的表达，并且减少凋亡相关蛋白的表达量，提示NF-κB在恶性肿瘤进程中起抗凋亡作用[15]。在本次研究中检测发现肺癌组织的细胞凋亡指数显著低于癌旁正常肺组织，并且发现NF-κB p65 mRNA表达水平和肺癌组织的细胞凋亡指数呈负相关，提示NF-κB促进肺癌细胞的分化、增殖，发挥抗凋亡作用。这也许可作为肺癌靶向治疗的一个位点，为我们临床治疗提供新的方法。在肺癌组织中小细胞癌组织的细胞凋亡指数较小，分析小细胞癌组织的细胞凋亡指数最小的原因可能和小细胞癌恶性程度高、细胞分化差有关。总之，本次试验通过研究肺癌组织标本中NF-κB-p65mRNA和CD15S蛋白表达及与肺癌浸润、转移、凋亡的关系，分析NF-κB-p65和CD15S蛋白在肺癌发生、浸润、转移中的作用和关系及NF-κB-p65和肺癌细胞凋亡指数关系，为探索肺癌发生、发展机制，寻找治疗新途径提供一定的理论依据。
(本文彩图见封三)
【参考文献】
1张伟东, 苗树军.我国恶性肿瘤死亡率流行病学特征分析.中国健康教育,2009,25(4):246-248.
2Sliva D, Rizzo MT, English D. Phosphatidylinositol 3-kinase and NF-kappaB regulate motility of invasive MDA-MB-231 human breast cancer cells by the secretion of urokinase-type plasminogen activator.J Biol Chem,2002,277(5):3150-3157.
3Dissanayake S, Shahin A. Induction of interferon-gamma by Taenia crassiceps glycans and Lewis sugars in naive BALB/c spleen and peritoneal exudate cells.Mol Immunol,2007,44(7):1623-1630.
4Schlotter CM, Vogt U, Allgayer H,et al.Molecular targeted therapies for breast cancer treatment.Breast Cancer Res,2008,10(4):211.
5Lee SY, Cho JS, Yuk DY,et al.Obovatol enhances docetaxel-induced prostate and colon cancer cell death through inactivation of nuclear transcription factor-kappaB.J Pharmacol Sci,2009,111(2):124-136.
6Zhang Z, Ma J, Li N,et al. Expression of nuclear factor-kappaB and its clinical significance in nonsmall-cell lung cancer.Ann Thorac Surg,2006,82(1):248.
7Hakomori S, Kannagi R.Glycosphingolipids as tumor-associated and differentiation markers.J Natl Cancer Inst,1983,71(2):231-251.
8Kashiwagi H, Kijima H, Dowaki S,et al. Clinicopathological significance of sialyl Lex expression in human gallbladder carcinoma.Oncol Rep,2004,11(6):1139-1143.
9Mizuguchi S, Nishiyama N, Iwata T,et al. Clinical value of serum cytokeratin 19 fragment and sialyl-Lewis x in non-small cell lung cancer.Ann Thorac Surg,2007,83(1):216-221.
10Shah MH, Sainger RN, Telang SD,et al. E-Cadherin truncation and sialyl Lewis-X overexpression in oral squamous cell carcinoma and oral precancerous conditions.Neoplasma,2009,56(1):40-47.
11Zhang BH, Chen H, Yao XP.E-selectin and its ligand-sLeX in the metastasis of hepatocellular carcinoma.Hepatobiliary Pancreat Dis Int,2002,1(1):80-82. Dabelsteen E,Cell surface carbohydrates as prognostic markers in human carcinomas.J Pathol,1996,179(4):358-369.
12Essani NA, McGuire GM, Manning AM,et al. Endotoxin-induced activation of the nuclear transcription factor kappa B and expression of E-selectin messenger RNA in hepatocytes, Kupffer cells, and endothelial cells in vivo.J Immunol,1996,156(8):2956-2963.
13Grünewald JK, Ridley AJ. CD73 represses pro-inflammatory responses in human endothelial cells.J Inflamm (Lond),2010,7(1):10.
14Zhang Z, Ma J, Li N, Ann Thorac Surg,et al.Expression of nuclear factor-kappaB and its clinical significance in nonsmall-cell lung cancer.Ann Thorac Surg,2006,82(1):243-248.
15Wang S, Liu Z, Wang L,et al. NF-kappaB signaling pathway, inflammation and colorectal cancer.Cell Mol Immunol,2009,6(5):327-334.